Analiza białek – przegląd technik pomiarowych

Analiza białek jest szczególnie istotna w wielu branżach i zastosowaniach. Białka, zwane również polipeptydami, to związki organiczne złożone z aminokwasów. Są podstawowymi jednostkami budującymi organizmy żywe, które uczestniczą w praktycznie każdym biologicznym procesie. Analiza oddziaływań między białkami jest kluczowa m.in. w projektowaniu i produkcji leków.

Białka różnią się między sobą w zależności od rodzaju, liczby i sekwencji aminokwasów, które tworzą szkielet polipeptydu. Odmienne struktury molekularne wpływają bezpośrednio na właściwości fizykochemiczne protein. Analiza białek w niniejszym artykule została opisana na podstawie kilku wybranych metod i technik badawczych.

1. Techniki separacji i wyznaczania masy cząsteczkowej

Jedną z podstawowych technik służących do charakteryzacji białek jest chromatografia wykluczania GPC/SEC. W metodzie tej roztwór białka przepuszczany jest przez wypełnioną porowatym żelem kolumnę, a poszczególne cząstki dyfundują do i z porów. Separacja oparta jest o wielkość cząsteczek – większe cząsteczki szybciej opuszczają kolumnę i trafiają do detektora jako pierwsze. Połączenie chromatografu żelowego z zaawansowanymi detektorami pozwala na pełną charakteryzację białek i polimerów pod względem rozkładu masy cząsteczkowej, stopnia zagregowania czy też konformacji cząsteczek.

Analiza białek za pomocą chromatografii wykluczania

Analiza białek za pomocą chromatografii wykluczania. Większe cząstki (kolor fioletowy) szybciej przepływają przez fazę Stacjonarną (żel), z kolei mniejsze cząstki (kolor czarny) wolniej przepływają przez wypełnioną żelem kolumnę. Na powyższym wykresie widoczny jest rozkład masy cząsteczkowej molekuł (białek), które zostały rozdzielone na 2 frakcje.

Innowacyjną metodą zapewniającą wydajną separację i charakteryzację białek, polimerów i nanocząstek jest Field-Flow Fractionation. Instrumenty wykorzystujące tę technikę charakteryzują się niezwykle wysoką rozdzielczością, dzięki której pozwalają na separację białek, peptydów i polimerów od 103 do 1012 Da. W przeciwieństwie do GPC/SEC cząstki rozdzielane są w otwartym kanale przepływu bez obecności fazy stacjonarnej. W tej technice, odwrotnie niż z chromatografii wykluczania, duże cząstki trafiają na detektor jako ostatnie. Analizatory wykorzystujące technikę FFF podobnie jak chromatografy żelowe kompatybilne są z szeregiem detektorów: stężeniowych (RI, UV lub RI/UV), statycznego rozpraszania światła (MALS) czy dynamicznego rozpraszania światła (DLS).

2. Analiza rozmiaru białek

Podstawową techniką służącą do analizy wielkości cząstek białek jest dynamiczne rozpraszanie światła (DLS). DLS zakłada, że zawieszone w cieczy cząstki poruszają się ruchami Browna z prędkością zależną od ich wielkości im mniejsze cząstki tym szybkość ich drgań jest wyższa). Próbka w trakcie pomiaru oświetlana jest laserem, którego światło zostaje rozproszone na cząstkach poruszająch się ruchami Browna. Powoduje to zmiany intensywności światła w czasie zależne od współczynnika dyfuzji cząstek w badanym roztworze. Następnie, wykorzystując równanie Stokesa-Einsteina, z danych rejestrowanych przez detektor wyznaczana jest średnica hydrodynamiczna molekuł.

3. Agregacja i mobilność białek

Wnikliwa analiza białek jest szczególnie istotna w procesie produkcji biofarmaceutyków, a kluczowe znaczenie dla oceny formulacji, w tym jej stabilności, ma analiza procesu agregacji makromolekuł. Ze względu na to, że agregaty o wielkości od 100 nm do 1 μm są szczególnie interesujące z punktu widzenia immunogenności, a zatem bezpieczeństwa produktu, istotne jest oznaczanie parametrów stabilności tychże produktów. Obecnie uznaje się, że nie tylko sam ładunek cząstek, lecz także ruchliwość elektroforetyczna determinuje ich stabilność w roztworze. Parametrem, który w prosty sposób określa skłonność białek zdyspergowanych w roztworze do agregacji jest potencjał zeta, do pomiaru którego wykorzystuje się analizatory pracujące w oparciu o technikę elektroforetycznego rozpraszania światła (ELS). Pomiar potencjału zeta połączony z wyznaczaniem wielkości cząstek przy pomocy dynamicznego rozpraszania światła w prosty sposób umożliwia określenie stanu agregacji białek i biofarmaceutyków.

4. Analiza stabilności termicznej białek, a także wiązań białek z innymi mikrocząsteczkami

Wśród technik pomiarowych wykorzystywanych do analizy stabilności termicznej białek można wyróżnić różnicową kalorymetrię skaningową. DSC (Differential Scanning Calorimetry) pozwala określić ciepło (energię) jakie musi być dostarczone do rozwinięcia natywnej formy białka, a także wyznaczyć zmianę pojemności cieplnej między formą natywną a zdenaturowaną. Wyznaczanie temperatury topnienia za pomocą mikrokalorymetrii DSC pozwala na określenie stabilności molekuły.

Techniką wykorzystywaną do analizy wiązań białek z innymi mikrocząsteczkami jest izotermiczna kalorymetria miareczkowa. ITC (Isothermal Titration Calorimetry) pozwala określić rodzaj i charakter wiązania, a także określić jak silne jest to wiązanie (entalpia i entropia) w danej temperaturze.

Analiza białek może być wykonana przy użyciu kalorymetru skaningowego MicroCal PEAQ-DSC oraz izotermicznego kalorymetru miareczkującego MicroCal ITC .

5. Analiza białek przy kontroli procesu produkcyjnego

Większość biofarmaceutyków wytwarzana jest z linii komórek ssaków. Dla uzyskania jak najlepszej jakości produktu konieczne jest dobranie odpowiednich parametrów bioreaktora. W trakcie samego procesu szczególnie istotne jest monitorowanie stężenia glukozy, które wpływa bezpośrednio na cykl metaboliczny komórek, ich rozmnażanie oraz produkcję metabolitów. Spektrometry Ramana firmy Kaiser Optical Systems umożliwiają pomiar stężenia glukozy w trybie ciągłym, a przez to optymalizację procesu produkcji biofarmaceutyków.

Instrumenty doskonale sprawdzają się także w monitorowaniu procesu oczyszczania białek. Zrozumienie procesu jest kluczowe, aby zapewnić najwyższą jakość produktu. Aktualne badania skupiają się na lepszym zrozumieniu etapów procesu, poprzez ilościowe pomiary kluczowych analitów, takich jak: aminokwasy, cukry i proteiny. Spektrometria Ramana pozwala na szybką i nieniszczącą analizę i ciągłą kontrolę.

Źródła:
malvernpanalytical.com
kosi.com