Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC) | Mikrokalorymetry

Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC) jest techniką wykorzystywaną do badania stabilności molekuł. Jest bardzo rozpowszechniona w inżynierii białek, projektowaniu leków i produkcji biofarmaceutycznej, czyli tam gdzie uzyskanie najtrwalszego związku jest najważniejsze.

DSC jest techniką analizy termicznej, która mierzy zmiany cieplne w molekule pojawiające się w trakcie kontrolowanego wzrostu (bądź spadku) temperatury, umożliwiając badanie biomolekuły w formie natywnej.

Różnicowa kalorymetria skaningowa umożliwia:

  • selekcję najbardziej stabilnych związków w badaniach nad biofarmaceutykami,
  • badania interakcji z ligandami,
  • szybką optymalizację warunków oczyszczania i produkcji,
  • szybkie określenie optymalnych warunków przechowywania dla preparatów ciekłych.

Zasada pomiaru DSC

Biomolekuła w roztworze występuje w równowadze między jej formą natywną (zwiniętą), a zdenaturowaną (rozwiniętą). Im wyższa temperatura przejścia fazowego (Tm), tym bardziej stabilna molekuła. Różnicowy kalorymetr skaningowy mierzy entalpię (ΔH) rozwijania, które wywołane jest podgrzewaniem. Skaningowa kalorymetria różnicowa jest również używana do wyznaczania zmian pojemności cieplnej (ΔCp) w wyniku denaturacji. DSC pomaga wyjaśnić czynniki, które przyczyniają się do zwijania i stabilności natywnych biomolekuł, w tym: interakcje hydrofobowe, wiązania wodorowe, konformacyjna entropia i wpływ środowiska.

Dokładność i wysoka jakość danych uzyskanych z eksperymentu DSC pomagają w procesie tworzenia potencjalnych terapeutyków.

Makromolekuły i kompleksy wielkocząsteczkowe (>5000 daltonów), takie jak białka, kwasy nukleinowe czy tłuszcze, tworzą dobrze opisane struktury, które przechodzą pod wpływem temperatury zmiany konformacyjne. Te rearanżacje strukturalne powodują absorpcję ciepła wywołaną przez zmianę i przeniesienie wiązań niekowalencyjnych. Skaningowe mikrokalorymetry różnicowe mierzą ilość absorbowanego ciepła.

skaningowa kalorymetria różnicowa DSC - wykresy

Rys. 1. Wykresy charakterystyczne dla skaningowej kalorymetrii różnicowej: zmiana pojemności cieplnej (ΔCp) w funkcji temperatury.

Jak działa różnicowy kalorymetr skaningowy?

Termiczny rdzeń każdego systemu DSC składa się z dwóch celek: referencyjnej i badawczej. Urządzenie jest zaprojektowane tak, aby przy podgrzewaniu utrzymać obie celki w tej samej temperaturze.

różnicowy kalorymetr skaningowy - schemat pomiaru

Rys. 2. Podczas pomiaru podgrzewane zostają: cela referencyjna i badawcza.

Wykonywanie pomiarów

Aby wykonać pomiar za pomocą DSC, najpierw celkę referencyjną należy wypełnić buforem, następnie celkę badawczą wypełniamy roztworem z naszą próbką. Następnie celki są podgrzewane w stałym gradiencie temperaturowym. Absorpcja ciepła, w wyniku rozwijania się łańcucha, powoduje powstanie różnicy temperatur obu celek (ΔT). To powoduje wzrost napięcia na ogniwach Peltiera, a tym samym wzrost energii, aby przywrócić zerową różnicę temperatur między celkami. W przeciwnym wypadku celki osiągnęłyby równowagę temperaturową tylko w wyniku pasywnego przewodnictwa cieplnego między sobą.

Generowanie danych i analiza

Entalpia rozwijania łańcucha białkowego jest polem powierzchni pod pikiem DSC (po znormalizowaniu stężeń) i jest wyrażona w kaloriach (bądź dżulach) na mol. Modele termodynamiczne pomagają nam również określić energię swobodną Gibbsa (ΔG), entalpię kalorymetryczną (ΔHcal), entalpię van`t Hoffa (ΔHvH), entropię (ΔS) i zmianę pojemności cieplnej (ΔCp) związanej z przemianą formy zwiniętej w rozwiniętą.

 

różnicowy kalorymetr skaningowy generowanie wyników

Rys. 3. Wyznaczanie parametrów termodynamicznych białek z wykresu.

Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC) – zastosowanie

Mikrokalorymetria DSC jest szeroko stosowana w odkrywaniu i rozwijaniu nowych leków.

Najczęstsze aplikacje to:

  • selekcja najbardziej stabilnych związków w badaniach nad biofarmaceutykami,
  • badanie interakcji z ligandami,
  • szybka optymalizacja warunków oczyszczania i produkcji,
  • szybkie określenie optymalnych warunków przechowywania dla preparatów ciekłych.

Rodzaj aplikacji i możliwości urządzenia są ogromne, ograniczeniem jest tak naprawdę możliwość wprowadzenia próbki do celi i potem bezproblemowego jej usunięcia. Urządzenie jest również bardzo czułe co musi się wiązać z odpowiednim dobraniem parametrów eksperymentu abyśmy byli w stanie zaobserwować i dobrze przeanalizować wyniki, które otrzymamy (granice temperaturowe skanu, szybkość skanowania, itp.).

Podsumowanie

Skaningowa mikrokalorymetria różnicowa jest bardzo szeroko stosowana w charakterystyce białek i innych makromolekuł z bardzo prostej przyczyny – jest nam w stanie dać bardzo dużo informacji o przemianie fizycznej, której ulega molekuła bez konieczności specjalnego przygotowania próbki. Często mówi się, że pomiar ciepła (kalorymetria) jest metodą fundamentalną – ciepło towarzyszy każdej przemianie fizycznej bez względu na jej rodzaj. Określenie temperatury topnienia (bądź temperatury przemiany fazowej w przypadku cząsteczek niebiałkowych) w połączeniu z entalpią całego procesu pozwala nam określić jak stabilna jest molekuła – wiele firm farmaceutycznych korzysta z bardzo szybkiej możliwości porównania wielu molekuł używając wersji z autosamplerem.

Analiza danych uzyskanych za pomocą mikrokalorymetru DSC jest również dość intuicyjna i prosta – najnowsze oprogramowanie dostarczane razem z urządzeniem MicroCal PEAQ-DSC firmy Malvern Panalytical w dużej mierze pomaga w tym często najtrudniejszym aspekcie pracy laboratoryjnej.