Statyczne rozpraszanie światła jest techniką szeroko stosowaną do wyznaczania masy cząsteczkowej makrocząsteczek takich jak na przykład białka czy polimery. W technice tej mierzone jest bezwzględne natężenie światła laserowego rozproszonego pod jednym lub wieloma kątami. Sygnał natężenia światła jest powiązany z masą cząsteczkową równaniem Rayleigha.
Małe cząsteczki rozpraszają światło izotropowo, czyli natężenie światła jest identyczne we wszystkich kierunkach. Jeżeli jednak cząsteczka jest większa pojawia się w niej więcej punktów rozpraszających światło i rejestrowane natężenie światła będzie zależało od kąta obserwacji. Jest to zjawisko zależności kątowej. Nie jest łatwo ustalić precyzyjną granicę między rozpraszaniem izotropowym a anizotropowym ale przyjmuje się ją na poziomie 1/20 długości fali lasera co przy świetle czerwonym (między 633 a 670 nm) daje nam wartość zbliżoną do ok. 15 nm promienia.
Równanie Rayleigha opisuje też zjawisko zależności kątowej ale jego dokładniejsza analiza pokazuje, że pomiar światła rozproszonego pod kątem 0 stopni eliminuje ten człon z równania. Oczywiście pomiar pod kątem 0 stopni nie jest możliwy do wykonania gdyż nie jesteśmy w stanie oddzielić światła rozproszonego od emitowanego przez laser. Z tego powodu dostępne są różne techniki różnie rozwiązujące ten problem.
RALS – prawokątowe rozpraszanie światła
Najprostszą techniką jest RALS (Right Angle Light Scattering – prawokątowe rozpraszanie światła) gdzie mierzymy sygnał pod kątem 90 stopni i zakładamy, że jest on taki sam jak przy kącie 0 stopni. W przypadku małych cząsteczek rozpraszających izotropowo jest to poprawne założenie. Dla takich obiektów technika działa pokazując swoje atuty – wysoką czułość i doskonały stosunek sygnału do szumu. Urządzenia wykorzystujące technikę RALS są proste konstrukcyjnie co wyraża się w stosunkowo niskiej cenie. Trzeba jednak pamiętać, że jest to technika stosowalna tylko dla małych makrocząsteczek.
Rys. 1. Statyczne rozpraszanie światła. Schemat detektora RALS oraz wykres Debye’a pokazujący zależność natężenia światła od kąta. W przypadku techniki RALS wykres Debye’a ogranicza się do jednego punktu gdyż zakładamy, że sygnał z kąta 90 stopni jest identyczny jak przy kącie 0 stopni.
LALS – niskokątowe rozpraszanie światła
Alternatywą dla RALS jest technika LALS (Low Angle Light Scattering – niskokątowe rozpraszania światła). Tutaj mierzymy światło rozproszone pod możliwie niskim kątem (przyjmuje się, że LALS to pomiary pod kątem niższym niż 10 stopni) i zakładamy, że sygnał będzie taki sam jak przy kącie 0 stopni. Oczywiście nie jest to pomiar przy kącie 0 stopni ale popełniany błąd dla kąta 7 stopni jest mniejszy niż 1%. Tak więc LALS może być stosowany dla dużych, rozpraszających anizotropowo cząsteczek ale w porównaniu z RALS jest to układ nieco bardziej skomplikowany i nie zapewnia tak dobrego stosunku sygnału do szumu. Nie jest to problem przy dużych, silnie rozpraszających cząsteczkach ale dla mniejszych może być kłopotliwe.
Rys. 2. Schemat detektora LALS i wykres Debye’a. Podobnie jak przy detektorze RALS wykres przyjmuje postać pojedynczego punktu, tym razem jednak położonego bardzo blisko osi Y.
Dostępne są także łączone detektory RALS/LALS, które wykorzystują technikę RALS do analizy małych cząsteczek i LALS do analizy większych obiektów wykorzystując zalety każdej z technik i eliminując ich ograniczenia. Dodatkowo dzięki dostępności dwóch kątów możemy wyznaczyć promień żyracji (Rg), chociaż nie jest to tak dokładne jak w przypadku opisanej poniżej techniki MALS.
Rys. 3. Budowa detektora RALS/LALS.
MALS – wielokątowe rozpraszanie światła
Kolejną techniką jest MALS (Multi Angle Light Scattering – wielokątowe rozpraszanie światła). Jak sugeruje nazwa tutaj mierzymy sygnał pod wieloma kątami i ekstrapolujemy go do kąta 0 stopni. Żeby dokonać ekstrapolacji konieczne jest wybranie modelu, który z kolei zależy od kształtu cząsteczki a ten nie zawsze jest znany. Kształt krzywej ekstrapolacyjnej będzie też zależny od ilości kątów, które bierzemy pod uwagę – w technice MALS usuwanie sygnału od pewnych kątów jest powszechnie stosowana praktyką gdyż skrajne kąty często mają zbyt słaby stosunek sygnału do szumu. Z kształtu krzywej ekstrapolacyjnej możemy także określić, ze znacznie większą precyzją niż w przypadku techniki RALS/LALS, promień żyracji Rg. Trzeba jednak pamiętać, że promień żyracji jesteśmy w stanie określić tylko dla większych cząsteczek rozpraszających anizotropowo. Dla mniejszych jest to nadal niemożliwe. MALS jest detektorem uniwersalnym. Może być stosowany w bardzo szerokim zakresie mas ale jest także znacznie bardziej skomplikowany co z jednej strony czyni go trudniejszym w ekstrapolacji zaś z drugiej strony droższym w zakupie.
Rys. 4. Budowa detektora MALS. Kąt nachylenia krzywej ekstrapolacyjnej na wykresie Debye’a w początkowej fazie (blisko osi Y) pozwala wyznaczyć promień żyracji Rg
Statyczne rozpraszanie światła w połączeniu z technikami separacji
Technika statycznego rozpraszania światła może być stosowana samodzielnie lub w połączeniu z techniką separacji (najczęściej GPC/SEC lub FFF). W przypadku samodzielnego urządzenia Użytkownik musi poświęcić bardzo wiele czasu na przygotowanie próbki i praktycznie stosowalność ogranicza się do próbek bardzo jednorodnych. Z tego powodu znacznie popularniejsze są detektory połączone z systemem separacji. Taki układ z jednej strony pozwala uzyskać precyzyjną informację o masie i jej rozkładzie także dla bardziej złożonych próbek jak również dodatkowe informacje z innych detektorów w systemie (RI, UV czy wiskozymetrycznego).
Źródła:
malvernpanalytical.com – white paper
postnova.com
