Statyczne rozpraszanie światła w pomiarach masy cząsteczkowej makrocząsteczek
Statyczne rozpraszanie światła jest techniką szeroko stosowaną do wyznaczania masy cząsteczkowej makrocząsteczek takich jak na przykład białka czy polimery. W technice tej mierzone jest bezwzględne natężenie światła laserowego rozproszonego pod jednym lub wieloma kątami. Sygnał natężenia światła jest powiązany z masą cząsteczkową równaniem Rayleigha.
Małe cząsteczki rozpraszają światło izotropowo, czyli natężenie światła jest identyczne we wszystkich kierunkach. Jeżeli jednak cząsteczka jest większa pojawia się w niej więcej punktów rozpraszających światło i rejestrowane natężenie światła będzie zależało od kąta obserwacji. Jest to zjawisko zależności kątowej. Nie jest łatwo ustalić precyzyjną granicę między rozpraszaniem izotropowym a anizotropowym ale przyjmuje się ją na poziomie 1/20 długości fali lasera co przy świetle czerwonym (między 633 a 670 nm) daje nam wartość zbliżoną do ok. 15 nm promienia.
Równanie Rayleigha opisuje też zjawisko zależności kątowej ale jego dokładniejsza analiza pokazuje, że pomiar światła rozproszonego pod kątem 0 stopni eliminuje ten człon z równania. Oczywiście pomiar pod kątem 0 stopni nie jest możliwy do wykonania gdyż nie jesteśmy w stanie oddzielić światła rozproszonego od emitowanego przez laser. Z tego powodu dostępne są różne techniki różnie rozwiązujące ten problem.
RALS – prawokątowe rozpraszanie światła
Najprostszą techniką jest RALS (Right Angle Light Scattering – prawokątowe rozpraszanie światła) gdzie mierzymy sygnał pod kątem 90 stopni i zakładamy, że jest on taki sam jak przy kącie 0 stopni. W przypadku małych cząsteczek rozpraszających izotropowo jest to poprawne założenie. Dla takich obiektów technika działa pokazując swoje atuty – wysoką czułość i doskonały stosunek sygnału do szumu. Urządzenia wykorzystujące technikę RALS są proste konstrukcyjnie co wyraża się w stosunkowo niskiej cenie. Trzeba jednak pamiętać, że jest to technika stosowalna tylko dla małych makrocząsteczek.
LALS – niskokątowe rozpraszanie światła
Alternatywą dla RALS jest technika LALS (Low Angle Light Scattering – niskokątowe rozpraszania światła). Tutaj mierzymy światło rozproszone pod możliwie niskim kątem (przyjmuje się, że LALS to pomiary pod kątem niższym niż 10 stopni) i zakładamy, że sygnał będzie taki sam jak przy kącie 0 stopni. Oczywiście nie jest to pomiar przy kącie 0 stopni ale popełniany błąd dla kąta 7 stopni jest mniejszy niż 1%. Tak więc LALS może być stosowany dla dużych, rozpraszających anizotropowo cząsteczek ale w porównaniu z RALS jest to układ nieco bardziej skomplikowany i nie zapewnia tak dobrego stosunku sygnału do szumu. Nie jest to problem przy dużych, silnie rozpraszających cząsteczkach ale dla mniejszych może być kłopotliwe.
Dostępne są także łączone detektory RALS/LALS, które wykorzystują technikę RALS do analizy małych cząsteczek i LALS do analizy większych obiektów wykorzystując zalety każdej z technik i eliminując ich ograniczenia. Dodatkowo dzięki dostępności dwóch kątów możemy wyznaczyć promień żyracji (Rg), chociaż nie jest to tak dokładne jak w przypadku opisanej poniżej techniki MALS.
MALS – wielokątowe rozpraszanie światła
Kolejną techniką jest MALS (Multi Angle Light Scattering – wielokątowe rozpraszanie światła). Jak sugeruje nazwa tutaj mierzymy sygnał pod wieloma kątami i ekstrapolujemy go do kąta 0 stopni. Żeby dokonać ekstrapolacji konieczne jest wybranie modelu, który z kolei zależy od kształtu cząsteczki a ten nie zawsze jest znany. Kształt krzywej ekstrapolacyjnej będzie też zależny od ilości kątów, które bierzemy pod uwagę – w technice MALS usuwanie sygnału od pewnych kątów jest powszechnie stosowana praktyką gdyż skrajne kąty często mają zbyt słaby stosunek sygnału do szumu. Z kształtu krzywej ekstrapolacyjnej możemy także określić, ze znacznie większą precyzją niż w przypadku techniki RALS/LALS, promień żyracji Rg. Trzeba jednak pamiętać, że promień żyracji jesteśmy w stanie określić tylko dla większych cząsteczek rozpraszających anizotropowo. Dla mniejszych jest to nadal niemożliwe. MALS jest detektorem uniwersalnym. Może być stosowany w bardzo szerokim zakresie mas ale jest także znacznie bardziej skomplikowany co z jednej strony czyni go trudniejszym w ekstrapolacji zaś z drugiej strony droższym w zakupie.
Statyczne rozpraszanie światła w połączeniu z technikami separacji
Technika statycznego rozpraszania światła może być stosowana samodzielnie lub w połączeniu z techniką separacji (najczęściej GPC/SEC lub FFF). W przypadku samodzielnego urządzenia Użytkownik musi poświęcić bardzo wiele czasu na przygotowanie próbki i praktycznie stosowalność ogranicza się do próbek bardzo jednorodnych. Z tego powodu znacznie popularniejsze są detektory połączone z systemem separacji. Taki układ z jednej strony pozwala uzyskać precyzyjną informację o masie i jej rozkładzie także dla bardziej złożonych próbek jak również dodatkowe informacje z innych detektorów w systemie (RI, UV czy wiskozymetrycznego).
Źródła:
malvernpanalytical.com – white paper
postnova.com