Statyczne rozpraszanie światła w pomiarach masy cząsteczkowej makrocząsteczek
Statyczne rozpraszanie światła jest techniką szeroko stosowaną do wyznaczania masy cząsteczkowej makrocząsteczek takich jak na przykład białka czy polimery. W technice tej mierzone jest bezwzględne natężenie światła laserowego rozproszonego pod jednym lub wieloma kątami. Sygnał natężenia światła jest powiązany z masą cząsteczkową równaniem Rayleigha.
Małe cząsteczki rozpraszają światło izotropowo, czyli natężenie światła jest identyczne we wszystkich kierunkach. Jeżeli jednak cząsteczka jest większa pojawia się w niej więcej punktów rozpraszających światło i rejestrowane natężenie światła będzie zależało od kąta obserwacji. Jest to zjawisko zależności kątowej. Nie jest łatwo ustalić precyzyjną granicę między rozpraszaniem izotropowym a anizotropowym ale przyjmuje się ją na poziomie 1/20 długości fali lasera co przy świetle czerwonym (między 633 a 670 nm) daje nam wartość zbliżoną do ok. 15 nm promienia.
Równanie Rayleigha opisuje też zjawisko zależności kątowej, ale jego dokładniejsza analiza pokazuje, że pomiar światła rozproszonego pod kątem 0 stopni eliminuje ten człon z równania. Oczywiście pomiar pod kątem 0 stopni nie jest możliwy do wykonania, gdyż nie jesteśmy w stanie oddzielić światła rozproszonego od emitowanego przez laser.
MALS – wielokątowe rozpraszanie światła
MALS (Multi Angle Light Scattering – wielokątowe rozpraszanie światła). Jak sugeruje nazwa tutaj mierzymy sygnał pod wieloma kątami i ekstrapolujemy go do kąta 0 stopni. Żeby dokonać ekstrapolacji konieczne jest wybranie modelu, który zależy od kształtu cząsteczki. Kształt krzywej ekstrapolacyjnej będzie też zależny od ilości kątów, które bierzemy pod uwagę – w technice MALS usuwanie sygnału od pewnych kątów jest powszechnie stosowana praktyką, gdyż skrajne kąty często mają zbyt słaby stosunek sygnału do szumu. Z kształtu krzywej ekstrapolacyjnej możemy także określić promień żyracji Rg. Trzeba jednak pamiętać, że promień żyracji jesteśmy w stanie określić tylko dla większych cząsteczek rozpraszających anizotropowo. Dla mniejszych jest to nadal niemożliwe. MALS jest detektorem uniwersalnym. Może być stosowany w bardzo szerokim zakresie mas dając informację na temat rzeczywistej masy cząsteczkowej badanych makrocząsteczek.
Rys. 4. Budowa detektora MALS. Kąt nachylenia krzywej ekstrapolacyjnej na wykresie Debye’a w początkowej fazie (blisko osi Y) pozwala wyznaczyć promień żyracji Rg
Statyczne rozpraszanie światła w połączeniu z technikami separacji
Technika statycznego rozpraszania światła może być stosowana samodzielnie lub w połączeniu z techniką separacji (najczęściej GPC/SEC lub FFF). W przypadku samodzielnego urządzenia Użytkownik musi poświęcić bardzo wiele czasu na przygotowanie próbki i praktycznie stosowalność ogranicza się do próbek bardzo jednorodnych. Z tego powodu znacznie popularniejsze są detektory połączone z systemem separacji. Taki układ z jednej strony pozwala uzyskać precyzyjną informację o masie i jej rozkładzie także dla bardziej złożonych próbek jak również dodatkowe informacje z innych detektorów w systemie (RI, UV czy wiskozymetrycznego).