W ostatnich latach rośnie zainteresowanie analizą egzosomów i mikropęcharzyków jako potencjalnych biomarkerów. Mimo tego pochodzenie komórkowe, funkcje i charakterystyka egzosomów nadal stanowią przedmiot wielu dyskusji. Przyjęto, że średnica egzosomów zawiera się w przedziale 30 – 100 nm, w odróżnieniu od większych mikropęcherzyków, których średnica wynosi 100 nm – 1 µm. Mikropęcherzyki są zwykle tworzone przez pęcherzyki błony plazmatycznej, podczas gdy egzosomy są uwalniane z endosomów w wyniku egzocytozy.
Do niedawna analizę egzosomów ograniczał brak odpowiednich technik. Gama instrumentów NanoSight dzięki unikalnej i sprawdzonej technologii pozwoliła zaspokoić tę potrzebę. W niniejszym artykule opisano metodę NTA, wykorzystywaną do pomiarów wielkości i stężenia egzosomów oraz mikropęcherzyków (analizę nano-zawiesin).
Omówienie metody NTA (Nanoparticle Tracking Analysis)
NTA służy do bezpośredniej i indywidualnej wizualizacji konkretnych egzosomów i mikropęcherzyków w zakresie 10 – 2000 nm. Metoda pozwala uzyskać wysokorozdzielczy rozkład wielkości oraz stężenia cząstek. Praca w trybie fluorescencyjnym umożliwia charakteryzację i różnicowanie odpowiednio znakowanych cząstek. Technika jest łatwa w użyciu, szybka, niezawodna i dokładna stanowiąca atrakcyjne uzupełnienie istniejących już metod.
Rys. 1. Schemat działania analizatora NanoSight, wykorzystującego do pomiaru technikę NTA.
NTA podobnie jak DLS opiera się na analizie ruchów Browna cząstek. W metodzie tej światło lasera oświetla zawieszone w cieczy cząstki, a pojawiające się rozbłyski rejestruje połączona z mikroskopem kamera. Dyfuzja cząstek wyznaczana jest poprzez śledzenie zmian położenia pojedynczej cząstki, a następnie przeliczana na średnicę hydrodynamiczną (wykorzystując równanie Stokesa-Einsteina).
Rys. 2. Zdjęcie z oprogramowania NanoSight przedstawiające cząstki poruszające się ruchami Browna. Zauważalna jest polidyspersyjność próbki świadcząca o obecności agregatów lub większych cząstek.
Rys. 3 [2]. Egzosomy – rozkład wielkości cząstek oraz przeliczone pierwotne stężenie próbki.
Egzosomy i mikropęcherzyki – inne techniki pomiarowe
Do innych metod charakteryzacji pęcherzyków o rozmiarach nano bądź mikro (analizy nano-zawiesin) należą:
- Cytometria przepływowa
- Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)
- Mikroskopia elektronowa (EM)
- Test immunoenzymatyczny (ELISA)
Najbardziej rozpowszechnioną metodą badania egzosomów i mikropęcherzyków jest cytometria przepływowa. Technika ta pozwala określić morfologię (wielkość i kształt) cząstek. Limit detekcji dla cytometrii (kuleczki polistyrenowe) wynosi około 300 nm. Zakres ten można rozszerzyć wykonując znakowanie fluorescencyjne, niemniej jednak dla mniejszych cząstek ze względu na poziom szumów wyniki pomiarów mogą być niezadowalające.
Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) pozwala z dużą dokładnością określić wielkość cząstek dla monodyspersyjnych próbek. Niemniej jednak obecność większych cząstek lub agregatów (co jest typowe w przypadku próbek zawierających egzosomy i mikropęcherzyki) zawyża otrzymywane wyniki.
Niezwykle użytecznym narzędziem do badań cząstek nano i mikro jest mikroskopia elektronowa, która z wysoką rozdzielczością pozwala określić kształt, wielkość oraz rozkład wielkości cząstek. Wadami metody są jednak wysoki koszt aparatury, a także złożone wymagania dotyczące przygotowania próbki.
Podsumowanie
NTA znakomicie sprawdza się w pomiarze wielkości i stężenia zarówno mikropęcherzyków jak i egzosomów. Metoda ta śledząc ruch pojedynczych cząstek pozwala przeprowadzić szybką, dokładną, a także selektywną analizę nawet najbardziej złożonych próbek stanowiąc doskonałe uzupełnienie innych technik pomiarowych.
Źródła:
[1] Malvernpanalytical.com
[2] C Gardiner, R Dragovic, A Brooks, D Tannetta, D Redman, P Harrison i I Sargent (2010) Nanoparticle Tracking Analysis for the Measurement and Characterisation of Cellular Microvesicles and Nanovesicles, Proc NVTH BSTH 2010.
