Znakowanie fluorescencyjne i analiza pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą NanoSight Pro

Badania nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EVs) zyskują coraz większe znaczenie ze względu na ich potencjał diagnostyczny i terapeutyczny. Początkowo traktowane jako produkt uboczny metabolizmu komórkowego, zostały obecnie rozpoznane jako kluczowe mediatory komunikacji międzykomórkowej. EVs obejmują różne podtypy, w tym małe EVs (<200 nm) i duże EVs (>200 nm). Egzosomy, zaliczane do małych EVs, pochodzą z błony plazmatycznej i odgrywają istotną rolę w transporcie białek, lipidów oraz kwasów nukleinowych. Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jest wyzwaniem ze względu na obecność innych składników w płynach ustrojowych, które tworzą złożony system wymagający zaawansowanych metod analizy. Parametry takie jak rozkład wielkości, stężenie i obecność specyficznych biomarkerów są niezwykle istotne dla określenia pochodzenia i funkcji EVs. Ponadto, zmiana ilości uwalnianych pęcherzyków może wskazywać na zwiększoną aktywność komunikacyjną, co ma duże znaczenie diagnostyczne.

Jak wspomniano wcześniej, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe zawierają białka, lipidy oraz kwasy nukleinowe, w tym RNA i DNA, a ich skład odzwierciedla stan fizjologiczny lub patologiczny komórki. Czyni to je obiecującymi biomarkerami m.in. w diagnostyce nowotworów, chorób neurodegeneracyjnych czy schorzeń zapalnych. Szczególną grupę markerów stanowią tetraspaniny (CD9, CD63, CD81), które są integralnymi białkami błonowymi obecnymi na powierzchni wielu podtypów EVs.

 

NanoSight i technika NTA

Do pełnej charakteryzacji EVs stosuje się wiele technik pomiarowych: cytometrię przepływową, western blot, ELISA, proteomikę spektrometrii mas, mikroskopię oraz analizę metodą Nanoparticle Tracking Analysis  (NTA). NTA jest metodą szybką i umożliwia precyzyjne określenie wielkości i stężenia pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. System NanoSight wykorzystuje laser do oświetlenia cząstek oraz mikroskop do obserwacji ich rozpraszania. Śledząc ruchy Browna, a następnie stosując równanie Stokesa-Einsteina, można określić średnicę hydrodynamiczną cząstek, a liczba zliczonych cząstek pozwala obliczyć stężenie. NanoSight Pro dodatkowo umożliwia analizę fluorescencji poprzez zastosowanie odpowiednich długości fali do wzbudzenia i filtry optyczne do analizy emisji, co pozwala na dokładne wykrywanie markerów powierzchniowych i ładunku EVs.

Materiały i metody

W tym badaniu wykorzystano liofilizowane egzosomy, pochodzące z moczu zdrowych dawców. Producent potwierdził obecność tetraspanin CD9, CD63 i CD81 metodami cytometrii przepływowej i western blot. Próbki były znakowane zgodnie z trzema strategiami: barwienie błon lipidowych (CellMask™ Orange i ExoGlow™), poprzez przeciwciała związane z fluorochromami skierowane przeciwko tetraspaninom oraz barwienie zawartości RNA Quant-iT™ RiboGreen.

Preparacja EVs

Liofilizowane egzosomy zostały odtworzone w wodzie dejonizowanej (mili-Q) (100 µl wody na 100 µg próbki), tworząc roztwór roboczy o stężeniu około 1 × 10¹² cząstek/ml.

Kontrola

Próbki kontrolne przygotowano poprzez rozcieńczenie wyjściowego roztworu egzosomów w stosunku 1:5000, metodą seryjnych rozcieńczeń z użyciem filtrowanego buforu fosforanowego (PBS, 1X) do końcowego stężenia około 2–5 × 10⁸ cząstek/ml, co stanowi odpowiednie stężenie do pomiarów NTA. Gotowe próbki kontrolne nie zawierały barwników, które analizowano równolegle z próbkami znakowanymi, aby ocenić wpływ fluoroforów na właściwości egzosomów.

Znakowanie błony lipidowej

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe dzięki obecności dwuwarstwy lipidowej stanowią idealny obiekt do barwienia barwnikami błonowymi. CellMask™ Orange (CMO) i ExoGlow™ wnikały do błony lipidowej zapewniając silny sygnał fluorescencyjny. Choć metoda ta nie jest specyficzna i może barwić także inne składniki posiadające błonę lipidową, jest przydatna do szybkiego potwierdzenia obecności EVs w próbkach.

Znakowanie tetraspanin – znakowanie specyficzne

Do wykrywania markerów powierzchniowych zastosowano przeciwciała sprzężone z fluoroforami Alexa Fluor® 488 i PE/Cyanine7, skierowane przeciwko CD9, CD63 i CD81. Inkubacja trwała 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie próbki rozcieńczano i poddawano analizie.

Znakowanie RNA

Do wykrywania RNA wewnątrz egzosomów zastosowano barwnik Quant-iT™ RiboGreen, który łączy się specyficznie z kwasami nukleinowymi. Egzosomy inkubowano z barwnikiem przez 30 minut, a następnie rozcieńczano do stężenia odpowiedniego dla NTA.

Omówienie wyników

Analiza metodą NanoSight Pro NTA pozwoliła na kompleksową ocenę właściwości egzosomów izolowanych z moczu zdrowych dawców. Wyniki obejmowały pomiary zarówno dane pochodzące z pomiaru całego spektrum światła rozproszonego (scatter) jak i fluorescencji, co umożliwiło ocenę skuteczności znakowania błon, obecności biomarkerów tetraspaninowych (CD9, CD63, CD81) oraz zawartości RNA.

Kontrole

Pomiar próbek kontrolnych (egzosomów bez barwników) przeprowadzony przy użyciu laserów 488 nm i 532 nm oraz odpowiednich filtrów szerokopasmowych wykazał brak autofluorescencji. Rozkłady wielkości cząstek w trybie scatter wykazały typową heterogeniczność dla próbek biologicznych – z modalnymi wartościami ok. 77 – 82 nm i stężeniami rzędu 3,9 – 4,5 × 10⁸ cząstek/ml (Rys. 6.). Ta obserwacja jest kluczowa, ponieważ potwierdza, że dodanie fluoroforów w dalszych etapach nie wpływa na wewnętrzne właściwości próbek.

 

Znakowanie błon komórkowych

Zastosowanie barwników CellMask™ Orange (CMO) i ExoGlow™ pozwoliło uzyskać bardzo wysoką efektywność znakowania (~100%). Rozkłady wielkości cząstek w trybie scatter i fluorescencji niemal idealnie się nakładały, co wskazuje, że cała populacja egzosomów została skutecznie oznakowana (Rys. 7).

Jednocześnie porównano fotostabilność fluoroforów. CMO wykazywał stabilny sygnał w czasie całego rejestrowanego filmu (150 klatek), natomiast ExoGlow™ cechował się wyraźnym spadkiem intensywności rozpraszania w trybie fluorescencji (Rys. 8). To oznacza, że CMO jest lepszym wyborem w przypadku długotrwałych pomiarów wymagających powtarzalności, podczas gdy ExoGlow™ może być stosowany przy krótkich pomiarach wstępnych.

 

Znakowanie tetraspanin (CD9, CD63, CD81)

Specyficzne znakowanie przeciwciałami sprzężonymi z Alexa Fluor® 488 oraz PE/Cyanine7 umożliwiło detekcję kluczowych markerów egzosomów. Dane wykazały, że w przypadku Alexa Fluor® 488 efektywność fluorescencji była wyższa (CD9: 40%, CD63: 46%, CD81: 33%), podczas gdy dla PE/Cyanine7 była znacznie niższa (od 10 do 35%) (Rys. 9). Różnice te wynikają z większej masy cząsteczkowej PE/Cy7, która może powodować efekt zawady sterycznej, ograniczający dostęp do epitopów.

Rozkłady wielkości dla obu fluoroforów były porównywalne do kontroli, choć dla PE/Cy7 obserwowano przesunięcie średnicy modalnej ku wyższym wartościom, co również potwierdza wpływ większej masy fluoroforu (Rys. 10). Wyniki te wskazują, że Alexa Fluor® 488 jest bardziej optymalnym markerem do badań EVs metodą NTA.

Znakowanie RNA

Znakowanie RNA przy użyciu Quant-iT™ RiboGreen wykazało, że około 54% egzosomów zawiera RNA. Modalna wielkość egzosomów oznakowanych RNA wyniosła ~82,5 nm, a stężenia odpowiednio: 2,3 × 10⁸ cząstek/ml (scatter) i 1,2 × 10⁸ cząstek/ml (fluorescencja) (Rys. 11). To sugeruje, że znaczna część egzosomów transportuje ładunek genetyczny, co podkreśla ich rolę w komunikacji międzykomórkowej i potencjale diagnostycznym.

 

Podobnie jak w przypadku ExoGlow™, RiboGreen wykazał ograniczoną fotostabilność, co uwidoczniło się w szybkim spadku liczby cząstek rejestrowanych w kolejnych klatkach (Rys. 12). Oznacza to, że pomiary RNA wymagają precyzyjnej optymalizacji warunków eksperymentalnych, aby zminimalizować efekt fotowybielania.

 

Wnioski

NanoSight Pro dzięki funkcji analizy fluorescencji umożliwia dokładną charakteryzację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pod kątem rozmiaru, stężenia, heterogeniczności, obecności biomarkerów oraz zawartości RNA. Barwniki błonowe pozwalają na szybkie potwierdzenie obecności EVs, przeciwciała sprzężone z fluoroforami umożliwiają selektywne wykrywanie markerów powierzchniowych, a Quant-iT™ RiboGreen daje możliwość oceny zawartości RNA. Łącznie metody te stanowią kompletne narzędzie do badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, wspierając ich wykorzystanie w diagnostyce i terapii.

 

Źródła:

Nota aplikacyjna firmy Malvern Panalytical – Unlocking insights: Mastering extracellular vesicle fluorescence labeling and analysis with Nanosight Pro