Jak spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) może odmienić procesy produkcyjne i badania jakości leków

Problem, który wciąż hamuje postęp: racemizacja w farmacji

W farmacji niezwykle istotnym zagadnieniem jest chiralność cząsteczek. Czym ona jest? Chiralność to cecha, która sprawia, że dana cząsteczka i jej lustrzane odbicie (tzw. enancjomery) nie są nakładalne na siebie – tak jak dłonie. Dwa enancjomery tej samej substancji mogą mieć zupełnie inne działanie biologiczne, pomimo identycznych właściwości fizycznych, co w kontekście leków ma krytyczne znaczenie.

Jednym z najlepiej znanych przypadków, gdzie nierozdzielone enancjomery spowodowały światową katastrofę jest lek talidomid, który w latach 50. i 60. był przepisywany kobietom w ciąży jako lek przeciwwymiotny. Niestety, jeden z enancjomerów miał działanie teratogenne, czyli prowadził do poważnych wad rozwojowych płodu. Od tego czasu przemysł farmaceutyczny kładzie szczególny nacisk na czystość chiralną substancji aktywnych.

Ale tutaj pojawia się problem: w większości przypadków reakcje chemiczne prowadzą do powstania mieszanin racemicznych – czyli zawierających oba enancjomery w równym stosunku. Taka mieszanka może być nie tylko mniej skuteczna, ale też niebezpieczna, ponieważ niepożądany enancjomer działa jak zanieczyszczenie farmaceutyczne, które trzeba usunąć.

Co rozróżnia enancjomery tego samego związku?

Spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) to technika spektroskopowa, która wykorzystuje zjawisko różnic w absorpcji lewo- i prawoskrętnego światła spolaryzowanego przez chiralne cząsteczki. Co to znaczy w praktyce?

Rysunek 1: Dichroizm kołowy: źródło światła składa się z równej ilości lewoskrętnego (niebieskiego) i prawoskrętnego (czerwonego) kołowo spolaryzowanego światła, z których jedno jest preferencyjnie absorbowane przez cząsteczkę chiralną. Mierzona jest różnica w absorbancji.

Należy założyć, że takie światło działa jak śruba. Enancjomery danego chiralnego związku różnie „odkręcają” lub „zakręcają” takie światło, co powoduje różnice w ich sygnale CD. Właśnie to zjawisko obrazuje spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) – umożliwia ona bezpośrednie rozróżnienie i ilościową analizę enancjomerów, nawet w złożonych układach wieloskładnikowych.

Praktyczne zastosowanie spektroskopii CD do analizy zawartości enancjomerów w produkcie syntezy leków

W nowatorskiej pracy opublikowanej w Molecular Pharmaceutics (2023), zespół badawczy Maxime’a D. Charpentiera przedstawił przełomowe zastosowanie spektroskopii UV-CD w analizie i rozdziale lewetyracetamu – leku przeciwpadaczkowego. W powyższych badaniach przedstawiono strategię projektowania selektywnej kokrystalizacji tylko jednego z enancjomerów. Kokryształ to ciało stałe złożone z dwóch lub więcej różnych cząsteczek – najczęściej substancji czynnej (API) i tzw. koformera – które wspólnie tworzą jednorodną strukturę krystaliczną dzięki oddziaływaniom, takim jak wiązania wodorowe. Koformer to dodatkowa, zazwyczaj nieaktywna biologicznie cząsteczka (np. kwas organiczny), która pomaga w tworzeniu stabilnego kokryształu. Proces ich tworzenia nazywa się kokrystalizacją i polega na kontrolowanym krystalizowaniu obu składników z roztworu lub zawiesiny. W farmacji kokryształy pozwalają poprawić właściwości leków (np. rozpuszczalność, trwałość), a także – co szczególnie ważne – umożliwiają rozdział enancjomerów poprzez tworzenie selektywnych kokryształów tylko z jednym z nich.

Aby dokładnie oszacować stężenia poszczególnych enancjomerów i koformera w roztworze, wykorzystano analizę wielowymiarową PLS (ang. Partial Least Squares). Jest to statystyczna metoda regresji, która pozwala modelować zależność pomiędzy złożonymi danymi spektralnymi (UV i CD) a rzeczywistymi stężeniami składników. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie precyzyjnych wyników nawet w przypadku znacznego nakładania się sygnałów spektralnych poszczególnych cząsteczek. Jest to kluczowe w układach wieloskładnikowych, gdzie tradycyjne podejścia analityczne często zawodzą.

Co udało się osiągnąć we wspomnianych badaniach?

Dokładna analiza czterech chiralnych składników naraz – dwa enancjomery R i S, chiralny koformer (kwas (S)-mandelowy – S-MA) i rozpuszczalnik – acetonitryl (MeCN).
Modelowanie pełnych diagramów fazowych – możliwe stało się zaprojektowanie procesu krystalizacji enancjomerów dzięki pomiarom różnic w rozpuszczalności między czystym enancjomerem, racematem a kokryształem.
Zastąpienie kosztownych metod HPLC – metoda UV-CD z analizą statystyczną (PLS) osiąga dokładność porównywalną z chromatografią, ale bez potrzeby stosowania drogich kolumn enancjoselektywnych czy czasochłonnych metod ekstrakcji.

Rysunek 2: Graficzna interpretacja (niewymiarowa) czteroskładnikowego diagramu fazowego R/S/S-MA/MeCN oraz powiększony widok dwufazowych obszarów stabilności czystych faz stałych z odpowiadającymi im kolorowymi powierzchniami rozpuszczalności w stanie równowagi. Czarne trójkąty oznaczają punkty eutektyczne (odpowiadają one najniższej temperaturze, przy której dana mieszanina może pozostawać całkowicie w stanie ciekłym) w układach trójskładnikowych, a szare linie – linie eutektyczne wychodzące z tych punktów, reprezentujące linie składu cieczy nasyconych w dwóch fazach stałych z sąsiednich obszarów. Na przecięciu trzech linii eutektycznych znajdują się punkty czteroskładnikowe (czarne kwadraty), odpowiadające składowi cieczy nasyconej w trzech sąsiadujących obszarach faz stałych. Dla przejrzystości, rysunek nie przedstawia obszarów trójfazowych (obszary z trójkątami wiążącymi linie eutektyczne z dwiema fazami stałymi, w których są nasycone) ani obszarów czterofazowych (obszary, których granice tworzą punkty czteroskładnikowe połączone z trzema fazami stałymi w równowadze). Czarna przerywana linia wskazuje przekrój o składzie racemicznym (równym w R i S) w układzie czteroskładnikowym.

Dzięki powyższym modelom, przy użyciu pomiarów spektroskopii CD, możliwe jest:

Śledzenie zmian stężeń w czasie procesu krystalizacji
Obserwacja tworzenia się kokryształów (np. S:S-MA)
Opracowanie warunków sprzyjających selektywnej krystalizacji tylko pożądanego enancjomeru

Dlaczego warto wdrożyć CD-spektroskopię w produkcji farmaceutycznej?

1. Oszczędność kosztów

Mniej odczynników, brak potrzeby wielu kolumn chromatograficznych
Szybsze analizy, mniej etapów przygotowawczych
Eliminacja kosztownych prób i błędów w optymalizacji krystalizacji

2. Lepsza jakość leków

Monitorowanie czystości chiralnej na każdym etapie produkcji
Większa kontrola nad formą krystaliczną API
Możliwość projektowania kokryształów poprawiających biodostępność

3. Elastyczność i skalowalność

Możliwość analizy różnych związków chiralnych
Technika skalowalna do zastosowań przemysłowych
Integracja z automatyką procesową i analizą in-line

Jedną z największych zalet spektroskopii UV-CD jest możliwość integracji z procesami produkcyjnymi w czasie rzeczywistym (in-line monitoring). Technika ta może być stosowana jako część strategii PAT (Process Analytical Technology), promowanej przez FDA i EMA, która umożliwia kontrolę i optymalizację parametrów procesu bez konieczności zatrzymywania produkcji. Dzięki szybkiemu pomiarowi sygnału CD i analizie PLS można natychmiast wykrywać odchylenia w czystości chiralnej produktu i błyskawicznie reagować, zwiększając bezpieczeństwo i jakość leków.

Warto zaznaczyć, że spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) jest techniką dobrze rozpoznaną w dokumentacji regulacyjnej dotyczącej substancji chiralnych. W wytycznych ICH (np. ICH Q6A dotyczących specyfikacji jakościowych) oraz przez farmakopee, CD bywa wskazywana jako jedna z rekomendowanych metod identyfikacji i kontroli czystości chiralnej. Dzięki swojej czułości i specyficzności, może stanowić uzupełnienie lub alternatywę dla klasycznych metod HPLC – zwłaszcza tam, gdzie potrzebna jest szybkość analizy lub wieloskładnikowa interpretacja danych.

Podsumowując, spektroskopia CD z zaawansowaną analizą matematyczną to narzędzie przyszłości farmacji precyzyjnej. Umożliwia nie tylko kontrolę jakości, ale i projektowanie inteligentnych procesów rozdziału chiralnego – szybszych, tańszych i bardziej ekologicznych.

[1] Mol. Pharmaceutics 2023, 20, 616−629