Powierzchniowy rezonans plazmonowy (metoda SPR)

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR – ang. Surface Plasmon Resonance) jest efektem optycznym, który może zostać wykorzystany do badania wiązań molekuł w czasie rzeczywistym bez znakowania. Instrumenty SPR są używane do pomiaru kinetyki wiązania i powinowactwa molekuł. Metoda SPR może być stosowana np. do pomiaru wiązania pomiędzy dwoma białkami, białkiem i przeciwciałem, DNA i białkiem oraz w wielu innych kombinacjach. To jedna z niewielu technik, która oprócz siły wiązania pozwala również określić jego kinetykę.

Kinetyka wiązania może być określona tylko za pomocą techniki biosensorycznej, która dostarcza informacji o wiązaniu w czasie rzeczywistym, zarówno w faz asocjacji jak i dysocjacji. Dane te dają szczegółowy wgląd w siłę wiązania i stabilność interakcji, co ma krytyczne znaczenie w wielu branżach i zastosowaniach. Dzięki temu można określić, które molekuły wchodzą w interakcje, jaka jest podstawa chemiczna interakcji i jak silnie molekuły oddziałują ze sobą.

 

Powierzchniowy rezonans plazmonowy SPR wykres

Rys. 1. Wykres pomiaru SPR

Dane z SPR mają kluczowe znaczenie w wielu gałęziach przemysłu i od ponad 25 lat są wykorzystywane zarówno przez firmy z branży farmaceutycznej jak np. Pfizer, Roche, GSK, jak i jednostki badawcze i uczelnie na całym świecie.

Niektóre przykłady zastosowań obejmują:

  • Badania przesiewowe i rozwój nowych farmaceutyków i bioterapeutyków
  • Kontrola jakości w monitorowaniu bioprocesów
  • Opracowywanie nowych testów diagnostycznych
  • Odkrywanie i charakteryzowanie funkcji białek, mechanizmów chorobowych, itp.

Metoda SPR ma wiele zalet w porównaniu do innych, powszechnie stosowanych technik badawczych:

  • Nie wymaga znakowania (mniejszy koszt i łatwiejsze wykonanie)
  • Małe objętości próbek (100 – 200 µl)
  • Wysoka czułość (może być stosowany zarówno do małych cząsteczek jak i dużych białek)
  • Pomiar w czasie rzeczywistym (dający głębszy wgląd w kinetykę wiązania)
  • Pomiar ilościowy

Na czym polega powierzchniowy rezonans plazmonowy?

Powierzchniowy rezonans plazmonowy jest bardzo czuły na zmiany współczynnika załamania światła, dzięki czemu znakomicie sprawdza się w badaniu kinetyki wiązań. Instrumenty SPR składają się z optycznego systemu pomiarowego, systemu obsługi płynów oraz chipa (sensora).

Sensor SPR składa się z bardzo cienkiej warstwy złota nałożonej na szklane podłoże. Jego powierzchnia została odpowiednio zmodyfikowana chemicznie, aby ułatwić wiązanie cząsteczek na powierzchni. Cząsteczkę unieruchomioną na powierzchni czujnika nazywamy ligandem, zaś przepływającą przez sensor – analitem. Sensor połączony jest z układem płynów za pomocą małej celi przepływowej, dzięki czemu analit może być wstrzykiwany w różnych stężeniach i w bardzo powtarzalny sposób.

powierzchniowy rezonans plazmowy Sensor, ligand, analit

Rys. 2. Sensor SPR, ligand, analit

Metoda SPR zapewnia ciągły przepływ buforu przez celę przepływową i obszar chipa. Analit jest nastrzykiwany do przepływającego buforu, tak aby oddziaływał z powierzchnią sensora przez określony czas. Układ płynów jest również używany do unieruchamiania ligandów, regeneracji sensorów, czyszczenia i kondycjonowania systemu.

 

Cela przepływowa i obszar sensora SPR

Rys. 3. Cela przepływowa i obszar sensora

Układ optyczny składa się ze źródła światła i detektora. Źródło światła oświetla złotą warstwę naniesioną na sensor a detektor mierzy unikalne widmo optyczne wytworzone w wyniku zjawiska SPR. Większość instrumentów SPR wykorzystuje laser, który świeci przez pryzmat znajdujący się pod sensorem, wywołując zjawisko całkowitego wewnętrznego odbicia. Na powierzchni złota generowana jest fala plazmoniczna a pole elektryczne tej fali rozciąga się na setki nanometrów w przestrzeń ponad powierzchnią chipa. Odbite światło będzie miało charakterystyczny spadek intensywności pod pewnym kątem spowodowany przez falę plazmoniczną co zarejestruje detektor. Gdy analit zwiąże się z powierzchnią sensora, zmieni się współczynnik załamania światła w przestrzeni, w której rozchodzi się fala plazmoniczna, a kąt odbicia ulegnie przesunięciu. Wielkość przesunięcia zależy od tego jak duża masa materiału związała się z powierzchnią sensora, przesunięcie zaś może być mierzone w czasie zbliżonym do rzeczywistego.

Co dzieje się w trakcie pomiaru SPR?

W pierwszym etapie pomiaru SPR następuje unieruchomienie liganda na powierzchni sensora. Istnieje wiele różnych typów sensorów i wiązań chemicznych, które to umożliwiają na powierzchni. Po unieruchomieniu liganda pozostałe miejsca wiążące są blokowane a powierzchnia jest często kondycjonowana poprzez wstrzykiwanie buforu regeneracyjnego. Gdy powierzchnia jest odpowiednio przygotowana (w zależności od chemii sensora), porcja analitu o znanym stężeniu jest wstrzykiwana z określoną szybkością przepływu przez wyznaczony czas (potrzebny do jej asocjacji na sensorze). Czas, w którym analit przepływa przez celę przepływową i styka się z sensorem to faza asocjacji – analit wiążąc się z ligandem gromadzi się na powierzchni. Szybkość wiązania zależy od siły oddziaływania oraz szybkości przechodzenia analitu z roztworu do powierzchni sensora. Wiązanie analitu z ligandem powoduje wzrost sygnału do momentu osiągnięcia równowagi (jeżeli ta zostanie osiągnięta). Gdy analit przepłynie przez celę i zostanie zastąpiony buforem, nastąpi odrywanie analitu od powierzchni a sygnał zacznie się zmniejszać. Jeżeli wiązanie ligand-analit jest trudne do rozerwania, wstrzyknięty zostaje bufor regeneracyjny w celu rozbicia kompleksu ligand-analit – po tej operacji wolny ligand zostaje na powierzchni. Wstrzykiwanie analitu należy powtórzyć dla 3-5 różnych stężeń – jest to niezbędne do uzyskania wiarygodnych stałych kinetycznych.

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (metoda SPR) ligand

Rys. 4. Wiązanie i odłączanie analitu od ligandu

 

SPR równanie kinetyczne

Rys. 5. Równanie kinetyczne

Po zakończeniu eksperymentu Użytkownik otrzymuje zestaw krzywych wiązania, które mogą być dopasowane matematycznie z modelami interakcji w celu wyodrębnienia szybkości przyłączania, odłączania i ogólnego powinowactwa. Prawidłowe krzywe wiązania powinny być wykładnicze. Model wiązania 1:1 jest najprostszy – można dodać poprawki na transport masy lub bardziej złożone modele wiązania. Zestaw krzywych wiązania analitów jest dopasowywany globalnie, więc wartości kon i koff są generowane dla całego zestawu danych.

Krzywe wiązania dla różnych stężeń-min

Rys. 6. Krzywe wiązania dla różnych stężeń. Pomiar za pomocą systemu SPR – OpenSPR.

 

Źródła:
https://nicoyalife.com/nicoya-surface-plasmon-resonance-resources/what-is-spr/what-is-surface-plasmon-resonance/