Liposomy – charakteryzacja z wykorzystaniem technik: DLS, NTA i FFF

Liposomy dzięki swojej kompatybilności metabolicznej, niskiej toksyczności i biokompatybilności pełnią rolę systemów dostarczania leków, nośników substancji hydrofilowych czy wzmacniaczy odpowiedzi immunologicznej.

Jednymi z najpopularniejszych technik służących do pełnej charakteryzacji liposomów są: DLS (Dynamic Light Scattering), MADLS (Multi-Angle Dynamic Light Scattering), NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) oraz FFF (Field-Flow Fractionation).

Pomiar wielkości i stężenia liposomów za pomocą DLS/MADLS

Najpopularniejszą techniką służącą do pomiaru wielkości liposomów jest DLS. Na poniższym rysunku omówiono zasadę działania analizatorów wykorzystujących dynamiczne rozpraszanie światła:

Liposomy - pomiar wielkości za pomocą techniki DLS

Rys. 1. Pomiar wielkości liposomów za pomocą techniki DLS. Próbka oświetlana jest za pomocą lasera. Małe cząstki poruszają się szybciej, powodując gwałtowniejsze zmiany natężenia światła. Podstawowym wynikiem w technice DLS jest rozkład wielkości cząstek po natężeniu.

Do głównych zalet techniki DLS należą: możliwość wykonywania pomiarów w roztworze macierzystym; niewielka objętość próbki; łatwe i szybkie przygotowanie próbki. DLS jest jednak techniką bardzo wrażliwą na agregaty i słabo radzącą sobie z układami polidyspersyjnymi.

Nowoczesną odmianą techniki DLS jest MADLS (Multi-Angle Dynamic Light Scattering), wykorzystywana w analizatorze Zetasizer Advance. Technologia ta umożliwia pełną analizę próbki (pomiar wielkości cząstek i stężenia cząstek) przy trzech kątach detekcji w trakcie zaledwie 3 minut. Ponadto, MADLS zapewnia wyższą rozdzielczość analizy niż klasyczny, jednokątowy DLS.

Charakteryzacja liposomów za pomocą techniki NTA

Technika NTA w znacznej mierze opiera się na analizie obrazu. Poruszające się w zawiesinie nanocząstki oświetlane są promieniem lasera, a powstające rozbłyski światła rozpraszanego rejestruje połączona z mikroskopem kamera. Oprogramowanie wykorzystując otrzymany w ten sposób film śledzi tory ruchów pojedynczych cząstek, wyznacza z nich współczynniki dyfuzji, które następnie przelicza na średnice hydrodynamiczne.

Liposomy - rozbłyski światła rozproszonego

Rys. 2. Rozbłyski światła rozproszonego pochodzące od cząstek liposomów. Zdjęcie z filmu zarejestrowanego przez instrument NanoSight NS300.

NTA stanowi doskonałe uzupełnienie techniki DLS. Pomiar z wykorzystaniem NTA jest bardziej czasochłonny niż DLS, lecz uzyskany wynik ma znacznie wyższą rozdzielczość. W technice NTA możemy także wykorzystać zjawisko fluorescencji dzięki czemu uzyskujemy dodatkowe informacje na temat próbki jak np. stosunek ilości liposomów wypełnionych fluorescencyjnym lekiem do ich całkowitej liczby. Technika NTA wymaga niskiego stężenia próbki dlatego też analizy można prowadzić dla bardzo małych ilości materiału wyjściowego.

Liposomy – separacja za pomocą FFF

Field-Flow Fractionation to technika pomiarowa, która opiera się na fizycznej separacji nanocząstek. FFF występuje w wielu wariantach, różniących się mechanizmami separacji: przepływ krzyżowy, siła odśrodkowa, gradient temperatur, grawitacja. Do charakteryzacji liposomów możemy wykorzystać warianty AF2000 (Assymetric flow FFF), wykorzystujący przepływ krzyżowy i CF2000 (Centrifugal FFF) wykorzystujący siłę odśrodkową.

Schemat separacji liposomów

Rys. 3. Schemat separacji liposomów za pomocą przepływu krzyżowego występującego w platformie AF2000 Multiflow. Małe liposomy eluowane są z kanału jako pierwsze

Technika FFF jest znacznie bardziej skomplikowana niż opisane powyżej DLS i NTA. Jest też znacznie droższa w zakupie i późniejszej eksploatacji. Te wady jednak są kompensowane przez możliwości.

Do kanału FFF jesteśmy w stanie nastrzyknąć roztwór macierzysty bez konieczności jego uprzedniego przygotowania czy rozcieńczania. Po nastrzyknięciu następuje separacja liposomów na poszczególne frakcje różniące się wielkością dzięki czemu FFF jest w stanie ujawnić zarówno cząstki większe jak też mniejsze od głównej populacji widocznej w DLS czy NTA. Samo określenie wielkości może być zrealizowane na kilka sposobów gdyż FFF może być połączony z szeregiem detektorów takich jak między innymi DLS czy MALS. FFF może być także stosowany jako semi-preparatywna technika w połączeniu z kolektorem frakcji.

Podsumowanie

Jak więc widać istnieje szereg narzędzi pozwalających na charakteryzację liposomów. Trzeba jednak zdawać sobie sprawę z ich ograniczeń. Rosnące wymagania sprawiają, że coraz częściej dotychczasowe techniki stają się niewystarczające i konieczne jest sięgnięcie po nowe. Coraz częściej też pojawiają się także zalecenia, czy wręcz wymogi potwierdzenia wyniku z jednak techniki za pomocą innej.

 

Źródła:

Woodle M.C., Advanced Drug Delivery Reviews 16 (1995) 249-265

J. Colloid Sci. Biotechnol. 1, 147–168, 2012

Malvernpanalytical.com

postnova.com