Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest techniką używaną do ilościowych badań interakcji między molekułami. Mierzy ona bezpośrednio ciepło, które jest uwalniane bądź absorbowane w trakcie powstawania wiązania.
ITC jest jedyną metodą, która równocześnie ustala wszystkie parametry wiązania w pojedynczym eksperymencie. Nie wymaga żadnych modyfikacji reagentów biorących udział w wiązaniu, niepotrzebne są żadne znaczniki fluorescencyjne czy immobilizacja, ITC mierzy powinowactwo reagentów w ich formach niezmodyfikowanych.
Pomiar przepływu ciepła podczas wiązania umożliwia dokładne określenie stałej wiązania (KD), stechiometrii reakcji (n), entalpii (∆H) i entropii (ΔS). To przyczynia się do stworzenia kompletnego termodynamicznego profilu interakcji między molekułami. Izotermiczna kalorymetria miareczkowa wykracza poza powinowactwo między reagentami i pozwala wyjaśnić mechanizmy stojące za interakcjami molekularnymi. To głębsze zrozumienie wiązań między molekułami pozwala podjąć bardziej pewną decyzję w wyborze odpowiedniego związku.
Zasada pomiaru ITC
Izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC) jest używana do pomiarów reakcji pomiędzy molekułami. Metoda pomiaru pozwala określić powinowactwo wiązania, stechiometrię, entropię i entalpię wiązania powstającego między reagentami w roztworze, bez konieczności znakowania.
Gdy zajdzie reakcja, ciepło jest absorbowane bądź uwalniane i ten efekt jest mierzony przez czuły mikrokalorymetr podczas stopniowego miareczkowania ligandu do celi badawczej zawierającej makromolekułę.
Rys. 1. Zasada działania i podstawy eksperymentu ITC
Izotermiczna kalorymetria miareczkowa – jak to działa?
Termiczny płaszcz
W mikrokalorymetrze znajdują się dwie celki: jedna zawiera wodę lub bufor i działa jako celka referencyjna, druga zawiera próbkę. Izotermiczny kalorymetr miareczkujący musi utrzymać identyczną temperaturę w obu celkach. Detektory ciepła wyłapują różnicę temperatur między celkami podczas powstawania wiązania i przekazują informację do grzałek, które wyrównują temperaturę między celkami.
Przeprowadzanie pomiarów
Przed eksperymentem musimy ustawić temperaturę, w której chcemy przeprowadzić eksperyment. Ligand znajduje się w strzykawce, która jest umieszczona w bardzo precyzyjnym urządzeniu do nastrzyków (titrator). Titrator jest włożony do celki badawczej zawierającej molekułę. Serie małych porcji ligandu są dodawane do roztworu molekuły (np. białka). Jeśli wystąpi wiązanie ligandu z molekułą zmiany cieplne temu towarzyszące (wartości rzędu milionowych części stopnia Celsjusza) są zaobserwowane i zmierzone.
Od chwili pierwszego nastrzyku izotermiczny kalorymetr miareczkujący mierzy uwolnione/zaabsorbowane ciepło aż do chwili gdy reakcja tworzenia wiązania osiągnie równowagę i molekuła wysyci się ligandem. Przebieg krzywej po scałkowaniu pików z nastrzyków pozwala nam wejść w głąb reakcji i uzyskać bardzo wiele parametrów termodynamicznych wiązania.
Izotermiczna kalorymetria miareczkowa – wyniki i analiza danych
W przykładzie, który jest poniżej, reakcja jest egzotermiczna co oznacza, że w celce badawczej w jej wyniku wydziela się ciepło i piki jakie obserwujemy są skierowane w dół. Podczas wyrównywania się temperatur sygnał z urządzenia wraca do linii bazowej. Kolejna niewielka porcja ligandu jest dodawana do celki badawczej i następnie po raz kolejny mikrokalorymetr wyrównuje temperaturę między celkami. Stosunek molowy ligandu do molekuły jest stale podnoszony w wyniku kolejnych nastrzyków. Molekuła w celce badawczej jest coraz bardziej wysycana ligandem, następuje coraz mniej wiązań, co powoduje detekcję mniejszych ilości ciepła aż do momentu gdy w celce powstanie nadmiar ligandu w stosunku do molekuły czyli wysycenie roztworu molekuły.
Rys. 2. Reakcja wiązania ligandu z makromolekułą
Pole pod powierzchnią każdego piku jest integrowane i wykreślane w funkcji stosunku molowego ligandu do makromolekuły. Izoterma, którą uzyskujemy może być dopasowana do modelu wiązania zawartego w bazie urządzenia, zgodnego z powinowactwem molekuły do liganda (KD). Stosunek molowy na przegięciu izotermy wiązania określa stechiometrię reakcji. Diagram poniżej jest przykładem reakcji o stosunku molowym 1:1.
Rys. 3. Modelowy przykład reakcji o stechiometrii 1:1
Entalpia (ΔH) również jest odczytywana bezpośrednio z wyznaczonej przez oprogramowanie izotermy i jest ilością ciepła uwolnionego bądź zaabsorbowanego przez mol związanego z molekułą liganda. To wszystko znaczy, że pojedynczy eksperyment ITC (izotermiczna kalorymetria miareczkowa) daje nam bardzo dużo informacji o reakcji, która zachodzi w celce – to pozwala zrozumieć naturę interakcji i jej aspekty termodynamiczne.
ITC jest bardzo szeroko stosowane w odkrywaniu i rozwijaniu nowych leków, a w szczególności do:
- określenia powinowactwa reagentów,
- selekcji i wyboru potencjalnych związków leczniczych,
- pomiaru termodynamiki,
- opisu mechanizmu wiązania,
- potwierdzenia ilości miejsc wiążących w projektowaniu małocząsteczkowych leków,
- opisywania specyficzności i wyznaczania stechiometrii reakcji,
- badań nad kinetyką enzymatyczną.
Rys. 4. Izotermiczny kalorymetr miareczkujący MicroCal PEAQ-ITC
