HPLC (High Performance Liquid Chromatography) – wysokosprawna chromatografia cieczowa

Chromatografia, jako jedna z czołowych metod analitycznych, zajmuje kluczowe miejsce zarówno w laboratoriach kontrolno‑pomiarowych, jak i naukowo‑badawczych. Wśród różnych technik chromatograficznych, szczególną uwagę warto poświęcić metodzie HPLC (High-Performance Liquid Chromatography – wysokosprawna chromatografia cieczowa). Jej wyjątkowe zalety sprawiają, że jest powszechnie stosowana do precyzyjnej analizy skomplikowanych mieszanin chemicznych.

Jak działa HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa)?

HPLC to technika wykorzystująca ciecz jako fazę ruchomą. Proces rozdziału chromatograficznego odbywa się w kolumnie wypełnionej fazą stacjonarną. Kluczową rolę odgrywają tutaj właściwości chemiczne analizowanych związków, które wykazują różne powinowactwo do faz stacjonarnej i ruchomej. W efekcie, każdy związek ma inny czas retencji – czas potrzebny na przebycie drogi w systemie od momentu nastrzyku do wykrycia przez detektor. Dzięki temu możliwe jest dokładne rozdzielenie składników mieszaniny.

Właściwości fazy ruchomej

Faza ruchoma w HPLC odgrywa istotną rolę w procesie rozdziału. Jej skład jest dobierany w zależności od natury analizowanych związków. Zazwyczaj stosuje się układy dwóch lub więcej rozpuszczalników, co pozwala na uzyskanie optymalnego rozdziału. Warto wspomnieć o dwóch metodach elucji:

• Elucja izokratyczna – stały skład fazy ruchomej przez całą analizę.
• Elucja gradientowa – zmienny skład fazy ruchomej, który dostosowuje się w trakcie analizy, zwiększając ilość rozpuszczalnika odpowiedzialnego za lepsze wymywanie związków z kolumny.

Dobór warunków rozdzielania

Proces doboru warunków rozdzielania w HPLC może być wymagający i pracochłonny. Niezależnie od charakteru analizowanych związków oraz polarności faz stacjonarnej i ruchomej, w praktyce stosuje się kilka układów chromatograficznych:

• NP-HPLC (Chromatografia normalnofazowa) – faza stacjonarna jest polarna, a faza ruchoma niepolarna. Idealna do rozdziału związków bardzo niepolarnych, takich jak węglowodory.
• RP-HPLC (Chromatografia faz odwrotnych) – faza stacjonarna jest niepolarna, a faza ruchoma polarna. Używana do rozdziału związków organicznych polarnych i niepolarnych, takich jak aminokwasy, kwasy organiczne, leki, witaminy czy pestycydy. Kolumny mogą pracować w szerokim zakresie środowisk, od mało polarnych (metanol, acetonitryl) po polarne (roztwory kwasu fosforowego, sole, bufory) w zakresie pH od 2 do 8.
• IC-HPLC (Chromatografia jonowa) – faza stacjonarna jest anionowa lub kationowa, a faza ruchoma to wodne roztwory buforowe. Rozdzielane są związki jonowe lub jony nieorganiczne.

Tabela 1. Porównanie układów wysokosprawnej chromatografii cieczowej.

Układ HPLC	Faza Ruchoma	Faza Stacjonarna	Rodzaj rozdzielanych składników
NP-HPLC	Rozpuszczalniki organiczne o małej polarności: dicholormetan, octan etylu, heksan	Polarna Wypełnienie zawiera grupy silandiolowe, silanowe i silaksanowe	Związki organiczne o bardzo małej polarności np. węglowodory
RP-HPLC	Rozpuszczalniki organiczne o małej polarności: Metanol, acetonitryl, tetrahydrofuran Rozpuszczalniki polarne: Roztwory kwasu fosforanowego, roztwory soli, bufory	Niepolarna Wypełnienie zawiera modyfikowaną krzemionkę, czyli krzemionkę ze związanymi z nią grupami niepolarnymi o różnej długości łańcucha węglowego (C18, C8, C4)	Związki organiczne o małej i dużej polarności np.: jak aminokwasy, kwasy organiczne, leki, witaminy czy pestycydy
IC-HPLC	Wodne roztwory buforowe	Wymieniacze jonowe osadzone na żelu krzemionkowym lub polimerze	Związki jonowe, jony nieorganiczne

Budowa chromatografu HPLC – schemat blokowy

Chromatografia cieczowa wysokosprawna (HPLC) jest jedną z najważniejszych technik analitycznych stosowanych w chemii, farmacji i biologii. Pozwala na precyzyjne rozdzielanie, identyfikację oraz oznaczanie ilościowe składników złożonych mieszanin. Kluczowe znaczenie mają poszczególne elementy aparatury, które umożliwiają przeprowadzenie analizy na wysokim poziomie dokładności i powtarzalności. W niniejszym artykule omówiono najważniejsze komponenty zestawu HPLC, w tym zbiorniki z eluentami, pompy, mieszalniki, dozowniki próbek, kolumny chromatograficzne, detektory oraz systemy wspomagające.

1. Zbiorniki z eluentami i odgazowywanie

Zbiorniki z eluentami przechowują fazę ruchomą, która jest tłoczona przez system pod wysokim ciśnieniem. Eluenty muszą być czyste i odgazowane, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które mogłyby zaburzyć stabilność przepływu oraz wyniki analizy. Odgazowywanie może odbywać się za pomocą próżni lub ultradźwięków.

2. Pompy

Pompy stanowią kluczowy element zestawu HPLC, zapewniając ciągły i precyzyjny przepływ eluentu przez układ. Najczęściej stosowane są pompy tłokowe, które pracują w sposób zapewniający stały przepływ bez pulsacji. W bardziej zaawansowanych systemach stosuje się pompy z dwoma tłokami pracującymi synchronicznie, co dodatkowo stabilizuje przepływ.

3. Mieszalniki i dozowniki próbek

Mieszalniki pozwalają na przygotowanie fazy ruchomej z kilku rozpuszczalników w odpowiednich proporcjach. Dozownik próbek, czyli tzw. autosampler, umożliwia automatyczne i powtarzalne wprowadzenie próbek do systemu. Zazwyczaj stosuje się dozowniki z pętlą, która umożliwia precyzyjne wprowadzenie określonej objętości próbki bez wpływu na ciśnienie i przepływ w układzie.

4. Termostat kolumny

Termostat kolumny to element, który stabilizuje temperaturę kolumny chromatograficznej, co jest kluczowe dla zapewnienia powtarzalności i dokładności analizy. Zmiany temperatury mogą wpływać na retencję składników oraz efektywność rozdzielania. Dlatego kolumna musi być utrzymywana w ściśle kontrolowanych warunkach termicznych, zazwyczaj w zakresie temperatur od pokojowej do około 80-100°C.

5. Kolumna chromatograficzna

Kolumna chromatograficzna jest miejscem, w którym zachodzi faktyczne rozdzielanie składników mieszaniny. Wypełnienie kolumny, które składa się z cząstek fazy stacjonarnej, oddziałuje z komponentami próbki, co prowadzi do ich separacji na podstawie różnych interakcji chemicznych i fizycznych.

6. Detektory: spektrofotometryczny i RI

Detektor spektrofotometryczny mierzy absorbancję światła przez składniki opuszczające kolumnę, co umożliwia ich identyfikację i ilościowe oznaczenie. Natomiast detektor refraktometryczny (RI) mierzy zmianę współczynnika załamania światła fazy ruchomej spowodowaną przez obecność rozdzielonych składników. Detektor RI jest szczególnie przydatny do analizy związków nieposiadających chromoforów, czyli takich, które nie absorbują światła UV/Vis.

7. System komputerowy

System komputerowy steruje pracą całego zestawu HPLC, umożliwiając nie tylko kontrolę nad warunkami analizy, ale także zbieranie, przetwarzanie i archiwizowanie danych analitycznych. Użytkownik ma możliwość monitorowania wszystkich parametrów pracy oraz optymalizacji warunków rozdzielania w czasie rzeczywistym.