Filtracja żelowa białek – 5 powodów, aby rozbudować system chromatograficzny

Filtracja żelowa, zwana również chromatografią wykluczania (ang. size-exclusion chromatography –  SEC), jest podstawową techniką charakteryzacji białek, wykorzystywaną w środowisku akademickim lub farmaceutycznym. Najczęściej do analiz, a w szczególności do wykrywania agregatów wykorzystuje się jednodetektorowe systemy SEC. Bardziej zaawansowanym, nowocześniejszym i alternatywnym sposobem charakteryzacji białek są systemy wielodetektorowe, które dostarczają znacznie więcej informacji w porównaniu do metody konwencjonalnej.

Systemy jednodetektorowe zawierają zazwyczaj detektor UV i są wykorzystywane do badania białek i identyfikacji obecności agregatów. Taka konfiguracja umożliwia również szacowanie masy cząsteczkowej, poprzez porównanie objętości elucji analitu z objętością elucji standardów o znanej masie cząsteczkowej.

Jednodetektorowe systemy filtracji żelowej SEC są szeroko stosowane i popularne m.in. dzięki swojej powtarzalności i odtwarzalności. Jednakże warto mieć na uwadze, że w przypadku zastosowania jednego detektora możemy również napotkać pewne ograniczenia tej techniki. Problem ten rozwiązano, rozbudowując system o dodatkowe detektory, co pozwoliło uzyskać wiele cennych informacji. Detektory rozpraszające światło, zarówno SEC-MALS (wielokątowe rozpraszanie światła), RALS (prawostronne rozpraszanie światła), jak i LALS (niskokątowe rozpraszanie światła), mierzą bezwzględną masę cząsteczkową z dużą dokładnością. Użycie detektorów rozpraszania światła pozwala szybko rozróżnić i określić ilościową zawartość oligomerów i większych agregatów. Analiza koniugatów pozwala scharakteryzować np. białka pegylowane, koniugaty przeciwciało-lek (ADC) lub białka błonowe, a do badania dużych zmian w konformacji białek wykorzystuje się detektor wiskozymetryczny.

Mając na uwadze powyższe możliwości, w niniejszym artykule wymieniono pięć powodów, dla których Twoje laboratorium może odnieść korzyści z zastosowania zaawansowanego, wielodetektorowego systemu filtracji żelowej SEC.

 

1. Bezwzględna masa cząsteczkowa w filtracji żelowej

Największym ograniczeniem konwencjonalnych pomiarów SEC jest sposób obliczana masy cząsteczkowej analizowanych związków. Masa ta obliczana jest na podstawie objętości retencji (która jest bezpośrednio związana ze średnicą hydrodynamiczną analitu) i porównania ze wzorcami masy cząsteczkowej (takimi jak seria białek globularnych). Z tego powodu wyniki są dokładne tylko w przypadku, gdy struktura analizowanego białka jest globularna i mieści się w zakresie krzywej kalibracyjnej. Konwencjonalna kalibracja nie uwzględnia wpływu struktury białka na czas elucji.

Masa cząsteczkowa tylko nielicznej grupy białek może zostać dokładnie zmierzona za pomocą tej metody.
O wiele częściej zakłada się, że głównym pikiem w separacji jest monomer, a wszystko inne – formą agregatu. W przypadku tylko niektórych aplikacji takie podejście może okazać się prawidłowe. Niemniej, otrzymujemy bardzo ograniczoną ilość informacji. Dodanie detektora rozpraszającego światło sprawi, że wszystkie pomiary masy cząsteczkowej będą dokładne bez względu na rodzaj mierzonego białka. Poznanie bezwzględnej masy cząsteczkowej białka umożliwia lepszą kontrolę nad jego zachowaniem i stabilnością, a w konsekwencji zapewnia lepszą jakość produktu. W badaniach naukowych bezwzględna masa cząsteczkowa dostarcza niezbędnych informacji na temat nowo oczyszczonego lub rekombinowanego białka oraz większą dokładność danych wykorzystywanych na potrzeby publikacji naukowych.

Pomiar bezwzględnej masy cząsteczkowej dostarcza wiarygodnej oceny stanu oligomerycznego białka. Wiele białek łączy się w multimery złożone z dwóch lub więcej podjednostek, co wpływa na ich aktywność lub stabilność. Na przykład, insulina, będąc aktywna jako monomer w celu zapewnienia stabilności podczas produkcji i przechowywania tworzy nieaktywny heksamer. W biofarmaceutyku różnica pomiędzy stanami oligomerycznymi może oznaczać różnicę pomiędzy stabilnością a szybką agregacją lub aktywnością a jej brakiem.

Dokładny pomiar stanu oligomerycznego białek wykonywany jest za pomocą wielodetektorowego SEC z detektorem rozpraszania światła. Na rysunku 2 pokazano chromatogram anhydrazy węglanowej. Próbka składa się z czterech populacji. Dzięki dokładności zmierzonych mas cząsteczkowych (przedstawionych w tabeli 1) – piki 2, 3 i 4 mogą być łatwo zidentyfikowane odpowiednio jako trimer, dimer i monomer. Stabilność zmierzonych mas cząsteczkowych w poszczególnych pikach wyraźnie wskazuje na to, że mamy do czynienia z odrębnymi populacjami. Masa cząsteczkowa piku 1 jest wyższa i bardziej zróżnicowana, co wskazuje na występowaniu większych aglomeratów. Możliwy jest również pomiar zawartości procentowej każdego piku w całej próbce. W ten sposób próbka jest o wiele dokładniej i wyraźniej scharakteryzowana, niż byłoby to możliwe przy użyciu systemu jednodetektorowego.

Filtracja żelowa - Chromatogram anhydrazy węglowej z powiązanymi zmierzonymi masami cząsteczkowymi

Rys. 2. Chromatogram anhydrazy węglowej z powiązanymi zmierzonymi masami cząsteczkowymi.

 

Tabela 1. Masa cząsteczkowa, rozmiar i wyniki strukturalne anhydrazy węglowej uzyskane w wyniku filtracji żelowej SEC.

Pik 1 2 3 4
Rv (mL) 17,04 17,54 18,37 20,01
Mw (Da) 125 800 87 640 58 750 29 200
Mw/Mn 1,019 1,000 1,000 1,000
Frakcja próbki (%) 0,883 1,311 6,439 91,370
Pik RI(mV.mL) 5,625 8,321 40,890 580,900
(Pik RALS(mV.mL) 2,889 2,982 9,825 69,390

2. Lepsza charakterystyka agregatów

Agregaty białkowe występują w różnych kształtach, rozmiarach, strukturach i konformacjach. Na przykład agregaty białek amyloidowych tworzą struktury w kształcie włókien, które m.in. przyczyniają się do choroby Alzheimera. Wiele innych białek tworzy agregaty, które są gęstymi i zwartymi cząstkami. Białka takie jak β-laktoglobuliny będą tworzyć agregaty o różnej strukturze w zależności od warunków powstawania. Oligomery, same w sobie, są często włączane do szerszego opisu „agregatów”. Oligomery są zazwyczaj odróżniane od innych agregatów przez ich stabilną masę cząsteczkową i aktywność. Możemy je łatwo zidentyfikować przez ich masę cząsteczkową, która jest zawsze wielokrotnością masy cząsteczkowej monomeru.

Wielodetektorowa chromatografia żelowa (filtracja żelowa) może wykraczać poza proste wykrywanie niezidentyfikowanych agregatów w próbce. Może mierzyć ich masę cząsteczkową i polidyspersyjność (czy są to agregaty o jednej masie cząsteczkowej, czy o różnych masach). Może nam również powiedzieć o ich strukturze lub czy te agregaty są globularne, cząsteczkowe, wydłużone lub włókniste. Takie informacje mogą pomóc w identyfikacji mechanizmów agregacji, jak również w określeniu ich miejsca biosyntezy, w którym agregacja może wystąpić.

Na rysunku 3 agregaty w próbce IgG są wyraźnie oddzielone od monomeru podczas zarejestrowanego chromatogramu przy pomiarze masy cząsteczkowej.

Agregaty eluujące po 10-11 minutach są słabo widoczne przez detektor RI, ale wyraźnie obecne w sygnale rozpraszania światła, co świadczy o jego czułości na te agregaty. Zatem samo użycie detektora RI dostarczy nam o wiele mniej informacji o zawartości agregatów w próbce, w porównaniu do detektorów RALS/LALS.

 

Próbka IgG zawiera monomer, dimer i agregaty wyższego rzędu

Rys. 3. Próbka IgG zawiera monomer, dimer i agregaty wyższego rzędu.

3. To, czego nie wiesz – MOŻE wprowadzić cię w błąd!

Jedną z kluczowych zalet konwencjonalnego, jednodetektorowego systemu kalibracji jest jego powtarzalność. Niemniej, dostarcza ona jedynie ograniczonych informacji. Mogą istnieć różnice pomiędzy próbkami, które nie są widoczne przy użyciu samego UV-SEC. Na przykład, to co wydaje się być prostym pikiem agregatu, może być oligomerem lub większym, bardziej nieuporządkowanym agregatem. W przypadku badań klinicznych po podaniu pacjentowi, reakcje na te dwa rodzaje agregatów mogą być znaczące i różnić się działaniem terapeutycznym. Oligomery mogą mieć większą lub mniejszą aktywność niż sam monomer, podczas gdy większe, nieuporządkowane agregaty będą zmniejszać jego skuteczność (poprzez redukcję miejsc aktywnych cząsteczek) i mogą mieć immunogenne skutki uboczne. Może się zdarzyć, że jeden z tych rodzajów agregatów wykazuje pożądane działanie kliniczne, podczas gdy drugi ma działanie zupełnie odwrotne. W konsekwencji niektóre partie terapeutyków mogą zostać odrzucone, mimo że są funkcjonalne lub, co gorsza, inne mogą zostać zaakceptowane, gdy w rzeczywistości nie powinny.

Jako przykład, chromatogram β-amylazy na Rys. 4. wydaje się pokazywać białko z pewnymi agregatami. Jednakże po bliższym zbadaniu przy użyciu wielodetektorowego systemu filtracji żelowej SEC pik 2 okazuje się być białkiem o zbliżonej masie cząsteczkowej. Objętość jego elucji nie jest taka sama jak β-amylazy, ponieważ ma ono zdecydowanie inną strukturę, o czym świadczy zmierzona lepkość graniczną i promień hydrodynamiczny [1].

Chromatogram β-amylazy z powiązanymi zmierzonymi masami cząsteczkowymi. Lepkość właściwa i promień hydrodynamiczny.

Rys. 4. Chromatogram β-amylazy z powiązanymi zmierzonymi masami cząsteczkowymi. Lepkość właściwa i promień hydrodynamiczny.

 

Tabela 2. Masa cząsteczkowa, rozmiar i wyniki strukturalne β-amylazy uzyskane w wyniku wielokrotnej detekcji.

Pik 1 2 3
Rv (mL) 12,930 14,600 15,970
Mw (Da) 9 543 000 208 500 212 800
Mw/Mn 6,138 1,001 1,001
IVw (dL/g) N/C 0,173 0,063
Rh(η)w (nm) N/C 8,283 6,000
Frakcja próbki (%) 0,357 28,190 71,450
Pik RI (mV.mL) 0,769 62,070 157,300
Pik RALS (mV.mL) 7,389 52,490 136,800

Założenia dotyczące agregacji oparte na pomiarach jednodetektorowych mogą prowadzić do błędnych wniosków na temat danej próbki białka. System wielodetektorowy wyjaśnia te różnice, pomagając w pełni scharakteryzować próbkę.

4. Skład koniugatu

Kompleksy różnią się zarówno pod względem liczby cząsteczek białka, jak i liczby cząsteczek koniugatu, które go tworzą. Może to być liczba sprzężonych cząsteczek leku lub PEG w ADC, lub w białkach PEGylowanych, co determinuje skuteczność, okres półtrwania i zdolność do transportu, lub może to być ilość detergentu dołączonego do białka błonowego po oczyszczeniu, co wpłynie na jego zdolność do krystalizacji.

System wielodetektorowy, zwłaszcza taki, który zawiera dwa detektory stężenia, może wykorzystywać różne odpowiedzi każdego detektora na każdy składnik koniugatu do dekonwolucji stężenia każdego składnika. Pozwala to na dokładny pomiar masy cząsteczkowej kompleksu i ostatecznie liczby przyłączonych cząsteczek koniugatu.

W poniższym przykładzie jeden z naszych klientów wykorzystuje analizę składu koniugatów do badania swoich białek PEGylowanych, pod kątem zawartości koniugatów, wolnych PEG i wolnych białek[2].

Wielodetekcja może zidentyfikować i scharakteryzować wolne białko, wolny PEG i koniugat białka w próbce mieszanej.

Rys. 5. Wielodetekcja może zidentyfikować i scharakteryzować wolne białko, wolny PEG i koniugat białka w próbce mieszanej.

5. Informacja o konformacji i kształcie

Lepkość właściwa jest miarą struktury, konformacji i upakowania cząsteczki. W przypadku białek jest to bezpośrednio związane z ich globularnością. Powszechnie spotykanie białka globularne mają niską lepkość wewnętrzną (wysoki stopień upakowania). Jednakże inne, takie jak przeciwciała lub białka wewnętrznie nieuporządkowane mają strukturę nieglobularną lub wydłużoną (niższy stopień upakowania).

Charakteryzując lepkość wewnętrzną białka, można zebrać informacje na temat jego konformacji i upakowania. Duże zmiany konformacyjne, które zachodzą w wyniku zmian środowiskowych lub wiązania innych cząsteczek, mogą być również monitorowane w celu wykrycia procesu fałdowania wewnętrznie nieuporządkowanego białka. Ze względu na to, że aktywność białek zależy od ich prawidłowej struktury, lepkość wewnętrzna jest potężnym narzędziem do charakterystyki tego zachowania.

Ostatecznie, informacje na temat lepkości wewnętrznej mogą być połączone z innymi pomiarami (na przykład z dynamicznym rozpraszaniem światła (DLS) lub analitycznego ultrawirowania (AUC)) w celu zbadania kształtu i stanu uwodnienia białka. Posiadając wszystkie te informacje, nasi klienci dokonują doskonałych pomiarów zmian strukturalnych i hydratacji białek w odpowiedzi na oddziaływania molekularne [3].

 

Źródła:

  1. Malvern Panalytical application note: Compositional insights for protein mixtures: a case study of a semi-pure β-amylase extract.
  2. Malvern Panalytical application note: PEGylated protein: Optimizing conjugation reactions using triple detection SEC.
  3. Calcium-induced folding of intrinsically disordered repeat-in-toxin (RTX) motifs via changes of protein charges and oligomerization states. Sotomayor-Perez et al. 2011.The Journal of Biological Chemistry Vol.286, pp. 16997.