Dichroizm kołowy (circular dichroism) jest to zjawisko bazujące na różnicach w absorbcji przez substancję światła spolaryzowanego kołowo prawoskrętnie oraz lewoskrętnie. Światło spolaryzowane lewoskrętnie kołowo i prawoskrętnie kołowo reprezentuje dwa możliwe stany pędu fotonu, dlatego dichroizm kołowy jest również nazywany dichroizmem dla spinowego momentu pędu. Dichroizm kołowy jest przejawem aktywności optycznej. Objawia się ona w pasmach absorpcyjnych optycznie aktywnych cząsteczek chiralnych.
Spektroskopia dichroizmu kołowego
Spektroskopia dichroizmu kołowego jest techniką, w której CD (Circular Dichroism) próbki jest mierzone w zakresie długości fal. Jest ona szeroko stosowana do badania chiralnych cząsteczek wszystkich typów i rozmiarów, ale to właśnie w badaniu dużych cząsteczek biologicznych znajduje swoje najważniejsze zastosowania.
Zasada działania polega na tym, iż badana próbka zawierająca białko lub inną substancję posiadającą aktywność optyczną jest wzbudzana liniowym światłem spolaryzowanym. Zjawisko dichroizmu kołowego skutkuje zmianą polaryzacji światła liniowego na eliptyczną. Powstałe światło spolaryzowane jest skierowane na próbkę i traktuje się je jako wektor elektryczny. Ten wektor elektryczny składa się z dwóch wektorów spolaryzowanych kołowo fal świetlnych. Mają one przeciwne kierunki rotacji (prawo i lewoskrętny), ale tę samą amplitudę oraz fazę.
Zastosowanie dichroizmu kołowego
Spektroskopia CD ma szeroki zakres zastosowań w wielu różnych dziedzinach. Ponieważ konformacja białka jest wrażliwa na środowisko, np. temperaturę, pH lub obecność ligandów, CD może być wykorzystana do obserwacji, jak zmienia się struktura drugorzędowa lub trzeciorzędowa w zależności od warunków środowiskowych lub interakcji z innymi cząsteczkami. Strukturalne, kinetyczne i termodynamiczne informacje o makrocząsteczkach mogą być uzyskane dzięki spektroskopii CD.
- UV CD jest używany do badania struktury drugorzędowej i trzeciorzędowej białek, porównania zmian struktur wyższego rzędu (HOS – Higher Order Structure).
- Składanie/rozkładanie białek, stabilność (termiczna/chemiczna). Badane mogą być zarówno rozpuszczalne jak i membranowe białka.
- UV/Vis CD jest używany do badania przejść ładunkowych.
- CD w bliskiej podczerwieni jest używany do badania struktury geometrycznej i elektronicznej poprzez sondowanie przejść orbitali metali.
- Wibracyjny dichroizm kołowy, który wykorzystuje światło z podczerwonego obszaru energetycznego, jest używany do badań strukturalnych małych cząsteczek organicznych, a ostatnio białek i DNA.
Dichroizm kołowy – aparatura
Doskonałym przykładem analizatora wykorzystującego zjawisko dichroizmu kołowego są urządzenia Chirascan brytyjskiej firmy Applied Photophysics.
Rys. 1. Analziator Chirascan V100 firmy Applied Photophysics.
Cechami wyróżniającymi analizatory Chirscan na rynku są:
- Półprzewodnikowy detektor LAAPD (Large area avalanche photodiode): Daje lepszy stosunek sygnału do szumu, co jest szczególnie korzystne przy niskich stężeniach próbki; daje również większy zakres długości fal niż PMT (Photomultiplier tube – fotopowielacz).
- Active Nitrogen Management System: System zarządzania azotem, który pomaga oszczędzać czas i azot.
- Kalibracja optyczna: Eliminuje problemy z kalibratorami chemicznymi, takimi jak CSA (kwas kamforosulfonowy).
- Oprogramowanie Global 3: Umożliwia analizę ciągłych, wielopoziomowych ramp temperaturowych, które dostarczają więcej danych w tym samym czasie, co klasyczne eksperymenty z rampami temperaturowymi.
