Detekcja UV/Vis w HPLC – fundament nowoczesnej chromatografii cieczowej

Detektory UV/Vis są wiodącym sposobem analizy w szerokiej gamie zastosowań wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Ich obecność jest widoczna w niemal każdej dziedzinie – od farmacji, przez analizę żywności, aż po monitoring środowiskowy.

Ich popularność wynika z bardzo dobrego kompromisu pomiędzy wydajnością a prostotą użytkowania. Wysoka czułość, stabilność pracy oraz niezawodność idą w parze z szeroką kompatybilnością z metodami chromatograficznymi, w tym z elucją gradientową. Dzięki temu detekcja UV/Vis sprawdza się zarówno w analizach rutynowych, jak i w bardziej zaawansowanych aplikacjach.

W dalszej części artykułu przybliżymy zasady działania detektorów UV/Vis, omówimy ich zalety oraz praktyczne ograniczenia. Zrozumienie podstaw techniki ułatwi efektywniejsze projektowanie metod i również trafniejszą interpretację uzyskiwanych wyników, co w praktyce przekłada się na większą pewność analizy.

 

Jak działa detekcja UV/Vis

Detektory UV/Vis w HPLC to urządzenia przepływowe, które mierzą absorpcję światła ultrafioletowego lub widzialnego przy jednej lub wielu długościach fali w momencie przejścia mieszaniny przez celę przepływową. Proces ten opiera się na prawie Lamberta-Beera, które opisuje zależność absorbancji od stężenia substancji: absorbancja jest wprost proporcjonalna do stężenia próbki znajdującej się w celi przepływowej.

W miarę eluowania związków z kolumny, te które absorbują światło przy wybranej długości fali zmniejszają intensywność światła docierającego do detektora. To zmniejszenie jest przekształcane w pik na chromatogramie. Sygnał ten może być wykorzystany do ilościowego oznaczenia związku opuszczającego kolumnę HPLC.

 

Chromofory – związki absorbujące światło UV lub widzialne

Absorpcja wynika zazwyczaj z przejść elektronowych w orbitalach molekularnych struktur takich jak:

• pierścienie aromatyczne
• sprzężone wiązania podwójne
• heterocykle
• chromofory peptydów i białek

W Tabeli 1 przedstawiono typowe maksima absorpcji UV dla różnych grup chromoforowych. Detektory UV/Vis mogą pracować w szerokim zakresie długości fal (np. 190–700 nm), co umożliwia detekcję dużej liczby różnych związków. Unikalne właściwości różnych grup chromoforowych sprawiają, że detekcja UV jest tak użytecznym narzędziem w analizie małocząsteczkowych związków farmaceutycznych i analitów biologicznych.

Grupa chromoforowa	Wzór	λmax (nm)	εmax
Alkin		225	160
Grupa karbonylowa		280	16
Grupa karboksylowa		204	41
Amid		214	41
Grupa azowa		339	5
Grupa nitrowa		280	22
Grupa nitrozowa		300	100
Grupa azotanowa		270	12
Olefina sprzężona		217 – 250	>20 000
Alkilobenzeny		250 – 260	200 – 300
Fenole		270	1 450
Anilina		280	1 430
Naftalen		286	9 300
Styren		244	12 000

Tabela 1: Przegląd właściwości absorpcyjnych UV grup funkcyjnych o charakterze chromoforowym.

 

Typy detektorów UV/Vis

W HPLC wyróżnia się trzy główne typy detektorów UV/Vis: detektory o stałej długości fali, detektory o zmiennej (VWD) lub wielokrotnej długości fali (MWD) oraz detektory z matrycą diod (DAD/PDA). Modele o stałej długości fali wykorzystują światło o jednej, określonej długości fali emitowane bezpośrednio ze źródła. Detektory zmiennofalowe i diodowe korzystają z szerokopasmowego źródła światła, umożliwiając wybór jednej lub wielu długości fali.

1. Detektory o stałej długości fali

Detektory te mierzą absorbancję tylko przy jednej długości fali. Są proste, niezawodne i ekonomiczne, zapewniając wysoką czułość dla określonych długości fal. Z tego względu często stosuje się je w systemach edukacyjnych, kompaktowych i przenośnych.

W starszych konstrukcjach stosowano lampy rtęciowe niskociśnieniowe (linia 254 nm). Dzięki dodatkom luminoforów lub zastosowaniu filtrów optycznych możliwe było uzyskanie innych długości fal. W nowoczesnych systemach lampy rtęciowe zostały w dużej mierze zastąpione przez diody LED ze względu na lepszą stabilność i trwałość.

Światło przechodzi przez celę przepływową zawierającą fazę ruchomą i analit, a następnie jest mierzone przez fotodiodę i przekształcane w sygnał elektryczny. W większości systemów stosuje się celę referencyjną, a różnica sygnałów przeliczana jest na absorbancję zgodnie z prawem Lamberta-Beera.

2. Detektory o zmiennej długości fali (UVD, VWD)

Detektory te również mierzą przy jednej długości fali, ale można ją dowolnie wybierać w szerokim zakresie (190–700 nm). Są standardem w rutynowej analizie HPLC.

Źródłem światła jest zazwyczaj lampa deuterowa. Widmo jest kierowane do monochromatora (szczelina wejściowa, siatka dyfrakcyjna, szczelina wyjściowa). Wybrana długość fali przechodzi przez kuwetę przepływową i jest mierzona przez fotodiodę.

W większości systemów stosuje się układ dwuwiązkowy: światło dzielone jest na wiązkę próbki i odniesienia. Tylko wiązka próbki przechodzi przez kuwetę.

Możliwość programowania długości fali w trakcie analizy zapewnia wysoką czułość i selektywność.

3. Detektory wielofalowe (MWD)

Detektory MWD mierzą absorbancję jednocześnie przy kilku długościach fal (zwykle 190–600 nm, czasem do 1000 nm). Najczęściej obsługują do czterech długości fal jednocześnie, co znacznie poszerza zakres danych uzyskanych podczas pojedynczej analizy.

Zwykle bazują na konstrukcji VWD i wykorzystują lampę deuterową, czasem uzupełnioną lampą wolframową dla zakresu światła widzialnego.

Detektory te stanowią atrakcyjny kompromis między VWD a DAD – oferują więcej informacji niż detektory jednofalowe przy niższym koszcie niż DAD.

4. Detektory diodowe (DAD/PDA)

 

Detektory DAD/PDA mierzą całe widmo UV/Vis jednocześnie (190–1000 nm). Zamiast pojedynczych długości fal rejestrują pełne widmo dla każdego piku.

Światło przechodzi przez kuwetę, a następnie jest rozszczepiane na matrycę fotodiod (256, 512 lub 1024). Powstaje trójwymiarowy zbiór danych (absorbancja vs czas vs długość fali).

Rejestrowanie pełnego widma pozwala na:

• Identyfikację związków na podstawie dopasowania widm UV/VIS oraz przeszukiwania bibliotek widmowych
• Ocenę czystości piku poprzez porównanie profili absorbancji w różnych punktach piku, co pozwala wykrywać współeluujące zanieczyszczenia lub związki o odmiennych widmach UV/VIS.
• Retrospektywny wybór długości fali bez konieczności ponownego wykonywania analizy — jeśli dane zebrano w trybie pełnego widma, chromatogram można przetworzyć dla innych długości fal na późniejszym etapie.
• Kompleksowy rozwój metod, szczególnie w przypadku próbek złożonych lub o nieznanym składzie.

Oczywiście, detektor DAD może również pracować w trybie rejestracji sygnału tylko dla jednej lub kilku długości fal.

Dzięki możliwości jednoczesnej kwantyfikacji przy wielu długościach fali oraz rejestracji pełnych widm, detektory DAD/PDA stały się standardem w nowoczesnych laboratoriach farmaceutycznych, analitycznych i badawczych. Oferują one bardzo dobry kompromis pomiędzy czułością, elastycznością i ilością uzyskiwanych danych, co jest szczególnie istotne w rozwoju metod oraz analizie złożonych mieszanin i próbek o nieznanym składzie.

Podsumowując, większa elastyczność DAD — zarówno w zakresie doboru długości fali, jak i dostępu do bardziej szczegółowych informacji o próbce — sprawia, że jest to pierwszy wybór w większości laboratoriów. W analizach rutynowych często jednak preferuje się prostsze detektory o zmiennej długości fali, ze względu na ich wyższą czułość.

 

Kluczowe parametry detektorów UV/Vis

• Czułość – anality zawierające grupy chromoforowe są wykrywalne, nawet gdy ich masa wynosi kilka nanogramów
• Liniowość – detektory UV/Vis cechują się znakomitym liniowym zakresem dynamicznym, często wynoszącym 4 – 5 rzędów wielkości
• Szum i dryf – niskie poziomy szumów oraz stabilna linia bazowa ułatwiają kwantyfikację, co ma szczególne znaczenie w metodach wykorzystujących gradient eluentów
• Cele przepływowe – cele w detektorach UV/Vis są najczęściej wykonane ze stali nierdzewnej, tytanu lub topionej krzemionki. Długość ścieżki przepływowej to zazwyczaj maksymalnie 50 mm lub mniej, a jej objętość mieści się w granicach 2 – 10 µl. Są projektowane z niską objętością martwą, aby zminimalizować poszerzanie pasm. Firma Knauer oferuje pełną gamę cel przepływowych do zastosowań analitycznych, preparatywnych oraz wymagających biokompatybilności (FPLC)

 

Zalety i ograniczenia detekcji UV/Vis

Detektory UV/Vis należą do najczęściej stosowanych detektorów w HPLC, ponieważ są proste, niezawodne i bardzo skuteczne dla wielu analitów. Większość niskocząsteczkowych związków farmaceutycznych, substancji czynnych (API) oraz wiele produktów naturalnych absorbuje promieniowanie UV, co sprawia, że technika ta jest standardowym wyborem w laboratoriach analitycznych i kontroli jakości, zarówno w analizach rutynowych, jak i w badaniach farmaceutycznych prowadzonych zgodnie z wymaganiami regulacyjnymi oraz podczas walidacji metod. Jednak jak każda technika, detekcja UV ma pewne ograniczenia.

Zalety:

• prosta i ekonomiczna aparatura
• wysoka niezawodność i łatwość obsługi
• minimalne wymagania eksploatacyjne
• wysoka dokładność i precyzja (<0,2% RSD) z szerokim zakresem liniowym (> 10⁵)
• wysoka czułość dla związków absorbujących UV
• kompatybilność z gradientem i większością powszechnie stosowanych eluentów
• detekcja nieniszcząca próbki

Ograniczenia:

• wymagana obecność grup chromoforowych
• niższa selektywność niż FLD czy MS
• zależność odpowiedzi od ε
• ograniczenia związane z cutoffem UV rozpuszczalników
• mniejsza czułość przy górnej i dolnej granicy spektrum

W praktyce, większość ograniczeń da się ominąć odpowiednim projektowaniem metod z użyciem wiedzy o teoretycznych podstawach techniki. Natomiast w przypadku związków nieposiadających chromoforów, stosuje się bardziej uniwersalne detektory, takie jak detektor współczynnika załamania światła (RID) czy detektor rozpraszania światła po odparowaniu (ELSD).

 

Uwagi dotyczące fazy ruchomej i UV cutoff

Rozpuszczalniki i dodatki mogą same absorbować promieniowanie UV. Dlatego przy stosowaniu detekcji UV/Vis w HPLC faza ruchoma musi być przezroczysta w UV przy wybranej długości fali detekcji, aby zapewnić wiarygodny pomiar.

UV cutoff rozpuszczalnika to długość fali, przy której jego absorbancja osiąga wartość 1 AU. Praca przy tej długości fali lub poniżej niej może prowadzić do wysokiej absorbancji tła, zwiększonego szumu oraz niestabilnej linii bazowej, co obniża czułość metody. Dlatego wybrana długość fali powinna znajdować się powyżej wartości UV cutoff danego rozpuszczalnika. Tabela 2 przedstawia wartości UV cutoff dla najczęściej stosowanych w HPLC rozpuszczalników i dodatków.

Należy również pamiętać, że składniki buforów oraz modyfikatory kwasowe mogą silnie absorbować poniżej 220–230 nm, co dodatkowo ogranicza możliwość pracy przy bardzo niskich długościach fali. Dobór rozpuszczalników i dodatków transparentnych w UV jest zatem istotnym elementem opracowywania metod HPLC, pozwalającym uniknąć wysokiego szumu i dryfu linii bazowej.

Eluent / Dodatek	UV cutoff
Woda	190 nm
Metanol	205 nm
Etanol	210 nm
Acetonitryl	190 nm
Izopropanol	210 nm
THF	212 nm
Heksan	200 nm
Kwas octowy	230 nm
Kwas mrówkowy	210 nm
TFA	210 nm

Tabela 2: Wartości UV cutoff dla powszechnie stosowanych w HPLC eluentów i dodatków

 

Kiedy detekcja UV/Vis działa najlepiej

Detekcja UV/Vis działa najlepiej dla związków, które silnie absorbują w zakresie UV (około 190–400 nm) i są stabilne w roztworze. Jest szczególnie skuteczna w przypadku analitów obecnych w umiarkowanych stężeniach oraz zawierających chromofory, takie jak pierścienie aromatyczne lub sprzężone wiązania podwójne.

Do typowych związków aktywnych w UV należą:

• farmaceutyki i substancje czynne (API)
• związki aromatyczne
• aminokwasy, peptydy i białka (zwykle detekcja przy 214, 220 lub 280 nm)
• pestycydy
• dodatki do żywności i barwniki
• produkty naturalne, takie jak flawonoidy i związki fenolowe

Wiele związków wykazuje również pewną absorpcję poniżej 220 nm związaną z przejściami σ → σ*, jednak przy tak niskich długościach fali coraz większe znaczenie ma absorbancja rozpuszczalnika.

 

Kiedy detekcja UV nie jest optymalna

Detekcja UV jest mniej odpowiednia dla związków pozbawionych chromoforów, takich jak:

• cukry
• triglicerydy i wiele lipidów
• małe kwasy organiczne
• niektóre polimery lub jony nieorganiczne

Analizy takich substancji charakteryzują się bardzo niską lub zerową absorpcją w UV, co przekłada się na słabą czułość. Problemy mogą również pojawić się przy bardzo niskich stężeniach analitu, w złożonych matrycach lub w przypadku współeluujących związków o podobnych widmach.

W takich sytuacjach lepszym wyborem mogą być inne detektory, takie jak ELSD, CAD, RID, FLD lub spektrometria mas (MS).

Ze względu na opisane wyżej właściwości detekcja UV/Vis znajduje szerokie zastosowanie w wielu obszarach. Obejmuje to m.in. analizę farmaceutyczną, gdzie wykorzystywana jest do zapewnienia jakości produktów poprzez oznaczanie zawartości, badanie zanieczyszczeń, jednorodności dawkowania oraz stabilności, monitoring środowiskowy do śledzenia związków aromatycznych i pestycydów w wodzie i glebie, a także analizę żywności i napojów, np. do oznaczania barwników i związków fenolowych w produktach takich jak wino czy herbata.

 

Podsumowanie

Detekcja UV/Vis stanowi fundament nowoczesnej chromatografii HPLC, ponieważ oferuje bardzo dobry kompromis pomiędzy czułością, prostotą obsługi, niezawodnością oraz kosztami.

Choć nie jest techniką uniwersalną, doskonale sprawdza się dla większości analitów aktywnych w UV obecnych w laboratoriach farmaceutycznych, środowiskowych, spożywczych oraz badawczych. Dodatkowo zastosowanie detektorów typu DAD/PDA znacząco zwiększa możliwości analityczne, przy jedynie niewielkim wzroście złożoności systemu.

Zapraszamy do zapoznania się z ofertą firmy Knauer na naszej stronie internetowej.

 

Źródło: https://www.knauer.net/blog/blog-9/seeing-is-believing-detection-made-easy-part-3-uv-vis-detectors-159